【摘要】：鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)為蘭科、石斛屬、多年生附生草本植物,其種子萌發(fā)需經(jīng)原球莖發(fā)育進(jìn)程而形成完整植株,根據(jù)其原球莖的形態(tài)特征可將該進(jìn)程劃分為七個時期,分別為種胚活化期(P1)、原球莖形成期(P2)、原分生組織形成期(P3)、頂端分生組織形成期(P4)、橢球形原球莖時期(P5)、葉原基維管系統(tǒng)形成(P6)和根端分生組織形成(P7)。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Amino acid transporter,AAT)是高等植物中介導(dǎo)氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一種膜蛋白,主要包括氨基酸多胺膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(APC)和氨基酸/生長素滲透酶家族(ATF)。APC家族共含有兩個亞家族,包括陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CATs),L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LATs);ATF家族包括氨基酸通透酶(AAPs),賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LHTs),脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ProTs),生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AUXs),氨基丁酸轉(zhuǎn)蛋白(GATs),芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ANTs)六個亞家族。本研究以鐵皮石斛作為材料,通過生物信息學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析以及實(shí)時熒光定量PCR等方法,探究DoAAT家族在鐵皮石斛原球莖發(fā)生過程中的作用。主要結(jié)果如下:(1)本研究通過Blast等方法自鐵皮石斛全基因組中鑒定出22個DoAAT超家族成員,其中DoCAT 5個、DoAAP 6個、DoLHT 3個、DoProT 1個、DoAUX 2個、DoGAT1個、DoANT 1個、DoLAT 3個。APC家族中兩個亞家族序列都具有一個或以上的AA permease結(jié)構(gòu)域,除此之外,CATs還具有一個AA permease C特征結(jié)構(gòu)域;ATF家族中各亞家族基因序列均含有一個AA trans結(jié)構(gòu)域;其中,LHTs還含有一個Trp-Tyr-perm特殊結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析表明,各鐵皮石斛氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均含有跨膜結(jié)構(gòu)域,且具有不含信號肽,是疏水性蛋白等特性;基因結(jié)構(gòu)中,DoAATs均具有激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件、組織表達(dá)元件、結(jié)合位點(diǎn)元件、代謝調(diào)節(jié)元件以及生理作用元件,表明該基因家族對鐵皮石斛生長發(fā)育起重要作用。系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明,鐵皮石斛氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與小蘭嶼蝴蝶蘭親緣關(guān)系性最為密,這符合其同為蘭科植物的特性。(2)通過高通量測序技術(shù)對鐵皮石斛原球莖P1-P5時期進(jìn)行二代和三代轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果分析表明共有19個DoAATs在此時期表達(dá),包括DoCAT 5個,DoLAT 3個,DoAAP 4個,DoLHT 2個,DoProT 1個,DoAUX 1個,DoGAT 1個,DoANT-like2個。結(jié)構(gòu)分析表明該家族成員基因序列具有可變剪接、SSR等結(jié)構(gòu),其中,可變剪切結(jié)構(gòu)使得該基因具有不同的剪切異構(gòu)體。GO分析表明該家族成員是各種細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的組成成分,參與氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),DoCAT主要介導(dǎo)賴氨酸、精氨酸、谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn),DoAAP家族主要參與酸性和中性氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),DoProT2參與脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn),DoGAT1參與氨基丁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。另外,該家族蛋白還與鐵皮石斛生長發(fā)育過程中某些生理作用有關(guān),如毒素分解、超敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞程序性死亡的負(fù)調(diào)控等。KEGG分析表明DoAUX參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,調(diào)節(jié)激素相關(guān)的生長和發(fā)育。差異基因表達(dá)結(jié)果表明DoAAP2、DoAAP4、DoLHT1在P1-P5時期表達(dá)量均較高,DoCAT1、DoLHT8、DoGAT1在P3-P5時期表達(dá)量較低,甚至不表達(dá)。(3)本文通過熒光定量PCR對DoAAP亞家族基因在鐵皮石斛種胚發(fā)育各個時期、各組織以及在寒冷和干旱脅迫下的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明DoAAP家族基因在鐵皮石斛原球莖發(fā)育的不同時期均表達(dá),所有基因在P1-P6時期均存在先上調(diào)后下調(diào)的過程,且在P7時期表達(dá)量升高。冷和干旱脅迫下,DoAAP亞家族的表達(dá)模式相同,DoAAP2、DoAAP3屬于正調(diào)控響應(yīng);DoAAP4、DoAAP7、DoAAP8屬于負(fù)調(diào)控響應(yīng);DoAAP6表達(dá)情況無規(guī)律,冷脅迫條件下的表達(dá)量均小于對照樣本的表達(dá)水平且上下波動,干旱脅迫時,DoAAP6僅在處理72h時表達(dá)量高于對照樣本,其他時間段表達(dá)量較低。綜上所述,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鐵皮石斛種子發(fā)育P1-P5時期可介導(dǎo)氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),不同亞家族所轉(zhuǎn)運(yùn)的氨基酸不同,為形成各種蛋白質(zhì)提供原料,對種子發(fā)育過程中原分生組織、頂端分生組織等結(jié)構(gòu)的形成具有重大功能。其中,DoAAP亞家族表達(dá)模式研究表明,該亞家族成員在P7時期表達(dá)量均較高,表明其在根端分生組織形成時期轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸活性最強(qiáng),預(yù)示對根的形成和生長發(fā)揮著極大作用。此外,DoAAT所參與的生理過程,如毒素分解等,表明該家族為鐵皮石斛正常發(fā)育提供保障。
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239
【圖文】：

2.2.4.2 跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測TMHMM Server 對鐵皮石斛氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白各亞家族成員進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果如圖2-1所示。結(jié)果顯示氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所有成員均具有跨膜結(jié)構(gòu)域，表明該家族蛋白與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，屬于跨膜蛋白。DoCAT 具有的跨膜結(jié)構(gòu)域較多，除 DoCAT5 僅具有 7 個跨膜結(jié)構(gòu)域外，其余成員均具有 13 ~15 個跨膜結(jié)構(gòu)域。DoLAT1、DoLAT3 具有 8 個跨膜結(jié)構(gòu)域，DoLAT2 具有 9 個跨膜結(jié)構(gòu)域。DoATF 家族中，除 DoAUX3 具有 7 個跨膜結(jié)構(gòu)域外，其余成員均具有 9 ~ 11 個跨膜結(jié)構(gòu)域

圖 2-2 鐵皮石斛氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守序列Fig. Conserved Sequences of Amino Acids Transporters in Dendrobium officinale注： Motif1 Motif2 Motif3 Motif4 Motif5 Motif6Motif7 Motif8 Motif9 Motif10 Motif11 Motif12Motif13 Motif14 Motif15 Motif16 Motif17 Motif18Motif19 Motif20表 2-6 鐵皮石斛氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白二級結(jié)構(gòu)組成預(yù)測Table 2-6 Composition of secondary structure of amino acid transporter蛋白質(zhì)名稱 α-螺旋 延伸鏈 β-轉(zhuǎn)角 無規(guī)卷曲DoCATDoCAT1 52.60% 13.57% 5.36% 28.48%DoCAT2 47.54% 14.15% 3.97% 34.34%255255255255255255255255255255255255255255255255255255255255

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本文編號：2739189