【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)以穿龍薯蕷種子為主要研究對象,通過對初生、次生代謝產(chǎn)物及代謝過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動態(tài)分析研究,探討環(huán)境因子對穿龍薯蕷種子萌發(fā)與代謝的影響,以期為提高藥材質(zhì)量與均一可控性提供依據(jù)。同時以全國不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子為研究對象,對其分級方法進(jìn)行研究,為穿龍薯蕷種子分級標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。材料與方法:1材料:本課題實(shí)驗(yàn)材料為不同產(chǎn)地的27批穿龍薯蕷種子,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為薯蕷屬植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino種子,其根莖入藥,藥材稱為穿山龍。2方法:2.1查閱古籍完成了穿山龍的本草考證并進(jìn)行薯蕷屬藥用資源研究。2.2采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn),并于相應(yīng)時間點(diǎn)收集樣品。利用人工氣候箱模擬不同溫度環(huán)境,測定相應(yīng)溫度條件下不同階段可溶性糖與丙酮酸兩種初生代謝產(chǎn)物,原薯蕷皂苷、原纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷五種次生代謝產(chǎn)物含量,根粗、莖粗等七項(xiàng)生長及生理指標(biāo),以及HMGR、FPS、CAS三種關(guān)鍵酶基因表達(dá)量,比較各成分間與指標(biāo)間相關(guān)性及不同溫度條件下各成分變化情況。2.3基于不同光照周期條件,采用紫外分光光度法測量穿龍薯蕷種子萌發(fā)過程中初生代謝產(chǎn)物產(chǎn)物含量,采用高效液相色譜法測量次生代謝產(chǎn)物含量,采用實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增法測定關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量,利用游標(biāo)卡尺和葉綠素測定儀測量其生長及生長及生理指標(biāo),并對所得結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。2.4基于不同光質(zhì)條件,采用紫外分光光度法測量穿龍薯蕷種子萌發(fā)過程中初生代謝產(chǎn)物含量,采用高效液相色譜法測量次生代謝產(chǎn)物含量,采用實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增法測定關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量,利用游標(biāo)卡尺和葉綠素測定儀測量其生長及生長及生理指標(biāo),并對所得結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。2.5匯總數(shù)據(jù),通過灰色關(guān)聯(lián)度法進(jìn)行不同類型環(huán)境間的橫向比較,選取主要指標(biāo),即初生代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、關(guān)鍵酶進(jìn)行分析,探求各指標(biāo)與溫度、光照周期、光質(zhì)間的密切程度。2.6參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》,對穿龍薯蕷種子凈度、含水量、百粒重、發(fā)芽率、生活力等指標(biāo)進(jìn)行測定,采用主成分分析、聚類分析、判別分析等方法將穿龍薯蕷種子分為不同等級,并得到穿龍薯蕷種子的分級判別式。結(jié)果:1通過查閱古籍完成了穿山龍的別稱考證、基原植物考證、產(chǎn)地考證、功效考證,完成了其近緣藥用植物功效研究。2相關(guān)性分析結(jié)果表明,初生代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物含量與HMGR、FPS基因表達(dá)量直接呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系,說明隨著穿龍薯蕷幼苗初生代謝產(chǎn)物的增加、關(guān)鍵酶活性的增強(qiáng),次生代謝產(chǎn)物也隨之增加,進(jìn)一步驗(yàn)證次生代謝產(chǎn)物是由可溶性糖、丙酮酸等轉(zhuǎn)化而來,豐富的初生產(chǎn)物有利于次生代謝產(chǎn)物的累積,且在不同溫度的影響下,次生代謝產(chǎn)物含量與HMGR、FPS的基因表達(dá)量密切相關(guān),即不同溫度條件主要通過調(diào)節(jié)HMGR、FPS的基因表達(dá)量來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的生成。同時通過折線圖可以直觀地看出原薯蕷皂苷累積的最適溫度為20℃,原纖細(xì)薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷最適溫度為25℃,甲基原薯蕷皂苷最適溫度為30℃,薯蕷皂苷最適溫度為15℃。3各指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在不同光照周期影響下初生、次生代謝產(chǎn)物均在日夜光照條件下增長速度最快,累積量顯著高于其他分組。由此證明,長時間光照更有利于藥材質(zhì)量的形成。可溶性糖與五種次生代謝產(chǎn)物均存在一定的正相關(guān)關(guān)系,丙酮酸與薯蕷皂苷呈顯著正相關(guān)關(guān)系。FPS、CAS與次生代謝產(chǎn)物存在正相關(guān)關(guān)系,說明在光照周期的影響下,次生代謝產(chǎn)物含量與FPS和CAS的基因表達(dá)量密切相關(guān),即不同周期的光照條件主要通過調(diào)節(jié)FPS、CAS的基因表達(dá)量來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的生成。4各指標(biāo)測定結(jié)果表明,可溶性糖在全光譜白光作用下累積量最多,薯蕷皂苷在紅光環(huán)境下累積最多,丙酮酸以及其他四種次生代謝產(chǎn)物均在白光條件下累積最為顯著�？扇苄蕴桥c原薯蕷皂苷、原纖細(xì)薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,丙酮酸與幾種產(chǎn)物均無顯著相關(guān)關(guān)系。FPS與原纖細(xì)薯蕷皂苷、薯蕷皂苷呈正相關(guān)關(guān)系,CAS與原纖細(xì)薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷呈正相關(guān)關(guān)系。5通過灰色關(guān)聯(lián)度分析法得出,可溶性糖、原薯蕷皂苷、原纖細(xì)薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的含量及HMGR、FPS、CAS基因表達(dá)量均與每日光照時間(即光周期)關(guān)系最密切,說明藥材栽培種植過程中可以通過控制光照周期最大程度上控制以上成分。6種子凈度、含水量、百粒重、發(fā)芽率、生活力可作為穿龍薯蕷種子分級的參考指標(biāo),依據(jù)這些指標(biāo)將全國不同產(chǎn)地27份種子分為2級,并得到穿龍薯蕷種子等級的判別式。結(jié)論:1通過查閱古籍對穿山龍進(jìn)行別稱考證、基原植物考證、產(chǎn)地考證、功效考證,我們發(fā)現(xiàn),穿山龍距今已有近200年的用藥歷史,雖然藥用歷史不是很長,但是在全國各地應(yīng)用廣泛,而且民間應(yīng)用很多。所以考證穿山龍的藥用記載,明確穿山龍?jiān)诟鞯貐^(qū)的藥用名稱尤為重要,這為穿山龍的廣泛使用提供依據(jù),為今后穿山龍的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。通過對其近緣性藥物的研究表明,薯蕷屬多種植物均含有大量的薯蕷皂苷,可以作為抗腫瘤、抗血栓形成、抗過敏、抗病毒和抗休克新藥的重要原料。2種子的好壞是保證其原藥材質(zhì)量優(yōu)劣的重要前提,種子是個體植株的雛形,萌發(fā)被認(rèn)為是植物一生中最重要的時期,因此,探究種子萌發(fā)過程的生理生化及代謝情況對穿龍薯蕷植物生長、藥材品質(zhì)均具有重要的意義。本研究首次對穿龍薯蕷萌發(fā)過程中初生、次生代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量進(jìn)行了測定,并得到了萌發(fā)過程中各成分間的相關(guān)性結(jié)果,證明植株生長發(fā)育過程中初生代謝產(chǎn)物在關(guān)鍵酶的作用下轉(zhuǎn)化生成次生代謝產(chǎn)物。通過比對不同溫度對次生代謝產(chǎn)物的影響得出,不同溫度下各成分含量累積量不同。提示我們可以通過控制溫度來調(diào)控關(guān)鍵酶活性,進(jìn)而調(diào)控某次生代謝產(chǎn)物含量,控制藥材質(zhì)量。3藥用植物的有效成分通常是其累積的次生代謝產(chǎn)物,光照周期對穿龍薯蕷種子萌發(fā)與代謝影響的實(shí)驗(yàn)表明,更長時間的光照有利于次生代謝產(chǎn)物的積累,即更長時間的光照有利于藥材質(zhì)量的提高。此結(jié)論可應(yīng)用于中草藥栽培種植產(chǎn)業(yè),通過人工干預(yù)增加光照時間提高藥材質(zhì)量。4本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),薯蕷皂苷在紅光作用下累積最多,其余四種皂苷均在白光作用下累積最多。因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)時可人工干預(yù)不同光質(zhì)的光源來控制不同皂苷類成分的含量,以控制藥材質(zhì)量。這對提高藥材質(zhì)量,控制藥材質(zhì)量均一化具有重要意義。5通過灰色關(guān)聯(lián)度分析法得出,穿龍薯蕷種子萌發(fā)期間各成分含量與每日光照時間(即光周期)關(guān)系最密切,說明藥材栽培種植過程中應(yīng)首先滿足足夠的光照時間這一條件,可以通過控制光照周期最大程度上控制各成分含量。這對穿龍薯蕷藥材栽培與種植有重要指導(dǎo)意義。6優(yōu)質(zhì)的中藥材種子是藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的重要保障,也是中藥材規(guī)范化生產(chǎn)的重要源頭。本研究首次采用了系統(tǒng)聚類、主成分分析、判別分析三種分析方法結(jié)合,對穿龍薯蕷種子進(jìn)行分級,并得到了種子質(zhì)量等級的判別式,為提高藥材質(zhì)量、落實(shí)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239
【圖文】：

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文植物考證匯編》、《中藥大辭典》、《中華本草》中和各地為薯蕷科植物穿龍薯蕷（Dioscorea nipponica M龍薯蕷的原變種柴黃姜（Dioscorea nipponica Ma. T.Ting）作為穿山龍藥材的一個來源。穿山龍的是各地區(qū)的名稱問題，如易與《滇南本草》中的過，葡萄科植物烏頭葉蛇葡萄（Ampelopsis aconitifo《中國經(jīng)濟(jì)植物志》中的粉萆參易與現(xiàn)在的藥用屬藥用植物，穿山龍的原植物最早見于吳其浚《

還有《中國經(jīng)濟(jì)植物志》中的粉萆參易與現(xiàn)在的藥用植物粉萆章薯蕷屬藥用植物，穿山龍的原植物最早見于吳其�！吨参飳�(shí)名 1-2。圖 1-1 《滇南本草》中的過山龍（伸筋草）

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