【摘要】：水稻開花期決定著水稻品種的地域分布、適應(yīng)性以及產(chǎn)量的潛能。穗型和粒形直接決定著水稻產(chǎn)量三要素中的每穗粒數(shù)和千粒重。對水稻開花期、穗型和粒形的調(diào)控基因進行功能解析,挖掘更多優(yōu)異的等位基因,有助于水稻的定向遺傳改良和分子設(shè)計育種。在30個水稻Dof基因成員中只有3個基因被證實參與抽穗期的調(diào)控。為了進一步挖掘Dof家族基因是否存在更多的抽穗期基因以及優(yōu)異的基因資源,本研究的第一部分主要圍繞水稻Dof家族基因的功能展開。粒形直接決定著千粒重,繼而影響水稻產(chǎn)量。本研究的第二部分圍繞一個水稻粒形基因WG7的功能展開的。主要研究結(jié)果如下:1.利用529份水稻種質(zhì)資源的抽穗期數(shù)據(jù),結(jié)合RiceVarMap網(wǎng)站上的基因型數(shù)據(jù),對30個水稻Dof家族基因進行單倍型水平上的關(guān)聯(lián)分析,共有22個Dof基因與抽穗期相關(guān)。這22個Dof基因分為三種類型。第一種類型有8個Dof基因(OsDof6,7,10,11,13,16,20和21),它們在長日照和短日照條件下,秈稻亞群和粳稻亞群單倍型之間都存在抽穗期的顯著性差異。第二種類型包括OsDof1和OsDof12,在長日照條件下,秈稻亞群和粳稻亞群單倍型之間都存在抽穗期的顯著性差異。但在短日照條件下,無論是秈稻還是粳稻單倍型之間都不存在顯著性的差異。第三種類型有4個Dof基因(OsDof23,25,29和30),它們無論在長日照還是在短日照條件下,只有粳稻亞群單倍型之間存在抽穗期的顯著性差異,而在秈稻亞群單倍型之間不存在顯著性差異。剩余的8個Dof基因單倍型之間沒有顯著性的差異。2.利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對30個Dof基因進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)11個基因和9個基因的CRISPR/Cas9突變體分別在長日照條件和短日照條件下有抽穗期的效應(yīng)。Dof家族的其他成員沒有抽穗期的效應(yīng)。此外,Dof家族部分基因的突變體對株高也有影響。3.核酸多樣性分析顯示有6個基因π_c/π_w比值都小于0.5,表明它們在馴化和遺傳改良過程中經(jīng)歷了選擇。在這6個基因中,OsDof2,16和24這3個基因調(diào)控抽穗期。OsDof7和OsDof21的Tajima’s D值在野生稻中是負(fù)數(shù)(P0.05),表明OsDof7和OsDof21已經(jīng)在野生稻中經(jīng)歷了純化選擇。此外,8個Dof基因(OsDof5,8,12,14,17,18,22和29)在栽培稻中以及3個Dof基因(OsDof3,5和7)在野生稻中的Fu and Li’s D值顯著偏離中性(P0.05),表明這些基因在野生稻中經(jīng)歷了自然選擇,并在栽培稻中經(jīng)歷了人工選擇。4.與野生型中花11相比,OsDof15的CRISPR/Cas9突變體顯著變小,特別是株高和穗型。OsDof15啟動子的T-DNA插入突變體植株較小,穗長較短,因此我們將該基因命名為SP3(Short Panicle 3)。轉(zhuǎn)基因互補以及CRISPR/Cas9敲除實驗,進一步證實SP3就是OsDof15。5.實時定量PCR和RNA原位雜交實驗顯示SP3特異地在幼穗中表達,尤其是在枝梗原基中(包括一次枝梗和二次枝梗原基)表達量最高。亞細胞定位結(jié)果顯示SP3是核蛋白,雙熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性實驗證明SP3是一個轉(zhuǎn)錄激活子。實時定量PCR和RNA原位雜交實驗證明SP3可以調(diào)控APO2/RFL的表達。6.細胞分裂素生物合成和降解相關(guān)基因分別在sp3突變體中的表達下調(diào)和上調(diào)最終導(dǎo)致sp3突變體內(nèi)源細胞分裂素含量的減少。7.我們發(fā)現(xiàn)一個T-DNA插入突變體,植株變小,粒形變窄,命名為wg7(wide grain 7)。測序結(jié)果顯示,T-DNA插入到LOC_Os07g47360基因的第7個外顯子中�；蛐头治鼋Y(jié)果顯示T-DNA插入與粒寬共分離,通過超表達以及CRISPR/Cas9敲除實驗,證實了WG7就是LOC_Os07g47360。8.穎殼切片以及電鏡掃描結(jié)果顯示細胞數(shù)目的差異是造成粒寬差異的主要原因,細胞周期相關(guān)基因的表達量在wg7突變體和野生型之間也有顯著性差異。9.利用酵母單雜交以及凝膠阻滯實驗找到了WG7結(jié)合的核心順式元件CATTTC,證實了OsMADS1是WG7的直接下游靶標(biāo)基因。雙熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性實驗證明了WG7通過直接結(jié)合到OsMADS1啟動子上的CATTTC元件上,激活OsMADS1的表達。對WG7結(jié)合的核心順式元件CATTTC的CRISPR/Cas9敲除證實了這種調(diào)控關(guān)系的真實性。10.WG7編碼一個含有CW結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白,染色質(zhì)免疫共沉淀和實時定量PCR結(jié)果顯示,在wg7突變體中,OsMADS1啟動子區(qū)域的組蛋白H3K4me3的含量顯著低于野生型。這些結(jié)果表明,WG7通過介導(dǎo)OsMADS1啟動子H3K4me3的修飾來調(diào)控OsMADS1的表達。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S511
【圖文】：

軸和小穗軸組成，小穗軸又由花梗和一次、二次甚至三次枝梗組成（圖 1-1A）形成和發(fā)育要經(jīng)過一系列分生組織的轉(zhuǎn)變和過渡，每一個分生組織轉(zhuǎn)變過渡都關(guān)重要的。營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的標(biāo)志是頂端分生組織（ShootapicalmeriM）向穗分生組織（Inflorescencemeristem，IM）的轉(zhuǎn)變。IM 具有枝梗分生組Branchmeristem，BM）的活性，IM 在產(chǎn)生適當(dāng)數(shù)目的一次枝梗分生組織（Primnchmeristem，PBM）后則不再繼續(xù)發(fā)育而形成退化點(Degeneratepoint，DP)失性。每一個 PBM 上，除了形成數(shù)量不同的二次枝梗分生組織(Secondary brristem，SBM)外，還會在一次枝梗上部繼續(xù)分化形成側(cè)生小穗分生組織(Laikeletmeristem，LSM)，LSM 具有側(cè)生花序結(jié)構(gòu)(Lateralspikelet，LS)的特性。枝生組織形成之后，小穗分生組織(Spikeletmeristem，SM)才得以形成；PBM 的最將分化成終端小穗分生組織(terminal spikelet meristem，TSM)。而著生于 PBM SBM 也進一步的向 SM 進行轉(zhuǎn)變。隨后，退化穎片、空穎、外稃、內(nèi)稃、以及和雌蕊原基相繼在小穗中產(chǎn)生（圖 1-1B）。

水稻 Dof 家族基因和粒形基因 WG7 的功能研究3 結(jié)果與分析3.1 Dof 家族基因的基因結(jié)構(gòu)利用已報道的 OsDof12 基因保守的 Dof 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列檢索 RGAP 數(shù)據(jù)庫和 NCBI 數(shù)據(jù)庫，共檢索到 30 個水稻 Dof 基因。這 30 個 Dof 基因在基因組中的分布是不均勻的，第 1 和第 3 染色體各自具有最多數(shù)量的基因（6 個），第 11 染色體上沒有 Dof 基因（表 1-2）。通常，Dof 家族基因具有相對簡單的結(jié)構(gòu)。在所有的 Dof基因中，17 個基因（56.7％），12 個基因（40％）和 1 個基因（3.3％）分別沒有內(nèi)含子，一個內(nèi)含子和兩個內(nèi)含子（圖 1-2）。

本文編號：2718240