【摘要】：小黑麥(Triticale)是由小麥屬(Triticum)和黑麥屬(Secale)通過(guò)屬間有性雜交和雜種染色體數(shù)加倍相結(jié)合的新物種。小黑麥籽粒的顏色多樣,其中藍(lán)色籽粒是由于糊粉層中富含花青素形成的,而藍(lán)粒性狀又可作為一種特殊的遺傳標(biāo)記,具有實(shí)際的育種價(jià)值,然而其分子遺傳機(jī)理目前尚不清楚。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析藍(lán)白色糊粉層中與花青素合成代謝通路有關(guān)的基因的表達(dá)水平,尋找差異表達(dá)基因,篩選出調(diào)控小黑麥糊粉層花青素合成的候選基因。利用生物信息學(xué)分析候選基因生物學(xué)特征,分離克隆候選基因,利用瞬時(shí)表達(dá)對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,主要研究結(jié)果如下:1、將小黑麥藍(lán)色和白色糊粉層進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到藍(lán)粒糊粉層原始數(shù)據(jù)11.08Gb,白粒9.74Gb,Trinty拼接得到有效數(shù)據(jù)20.82Gb,基因平均長(zhǎng)度為1683bp,共計(jì)73886個(gè)unigenes,蛋白同源比對(duì)表明小黑麥糊粉層中的蛋白與節(jié)節(jié)麥同源性最高,其次是大麥和小麥;和白粒相比,藍(lán)粒糊粉層中表達(dá)量上調(diào)的unigenes有7588個(gè),下調(diào)的unienes有25319個(gè)。GO功能分類(lèi)中與次生代謝有關(guān)的unigenes有808個(gè);KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)花青素生物合成約有100個(gè)差異unigenes;利用花青素合成代謝通路中的結(jié)構(gòu)基因篩選出86個(gè)同源基因,其中藍(lán)粒中花青素合成代謝通路中結(jié)構(gòu)基因大多數(shù)高于白粒,說(shuō)明藍(lán)粒中花青素生物合成通路被激活。此外篩選得到2個(gè)MYC和2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子,MYC轉(zhuǎn)錄因子Unigene5672_All(BcMYC1)在藍(lán)粒中的表達(dá)量是白粒的42倍MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene12228_All在藍(lán)粒中的表達(dá)量是白粒的2倍。在MYC轉(zhuǎn)錄因子Unigene5672_All(BcMYC1)中白粒表達(dá)下調(diào),而MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene12228_All中白粒有表達(dá),故篩選MYC轉(zhuǎn)錄因子BcMYC1作為調(diào)控藍(lán)粒糊粉層花青素合成代謝的候選基因。2、BcMYC1基因CDS序列1683bp,編碼560個(gè)氨基酸。利用ExPaSy-Prot param軟件分析結(jié)果顯示分子量為61870Da,等電點(diǎn)4.71,不穩(wěn)定指數(shù)為50.58,脂肪指數(shù)78.71。親水性系數(shù)-0.400,說(shuō)明BcMYC1蛋白具備親水性功能。根據(jù)SOPMA軟件分析得到BcMYC1基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(39.64%)、不規(guī)則盤(pán)繞(43.93%)、延伸鏈(11.96%)和β-轉(zhuǎn)角(4.46%)。使用TMHMM-2.0軟件分析顯示BcMYC1蛋白質(zhì)不通過(guò)跨膜區(qū)并作用于膜外。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)BcMYC1蛋白與小麥、矮牽牛、水稻等物種中調(diào)控花青素生物合成代謝相關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子聚為一類(lèi),說(shuō)明BcMYC1與bHLH轉(zhuǎn)錄因子同源。氨基酸比對(duì)顯示BcMYC1蛋白與控制小麥藍(lán)粒性狀主效基因ThMYC4E和控制紫粒小麥紫粒性狀主效基因T aMYC1在氨基酸序列中都含有bHLH-MYC_N domain、HLH domain和ACT-li ke domain,由此推測(cè)BcMYC1很有可能也是一個(gè)具有調(diào)控花青素生物合成的功能基因。RT-PCR定量分析,BcMYC1基因在藍(lán)粒中表達(dá)含量比白粒要高。利用Gateway克隆技術(shù),構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pBract214:BcMYC1。以bHLH轉(zhuǎn)錄因子ZmR做對(duì)照,利用基因槍瞬時(shí)介導(dǎo)將表達(dá)載體pBract214:BcMYC1與MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmC1混勻后一起轟擊到小麥白色的胚芽鞘中,在小麥白色Opata的胚芽鞘中產(chǎn)生數(shù)個(gè)紅色細(xì)胞,而單獨(dú)轟擊pBract214:BcMYC1、ZmR和ZmC1均無(wú)法誘導(dǎo)胚芽鞘產(chǎn)生紅色細(xì)胞,由此證明BcMYC1是具有調(diào)控花青素生物合成的功能。
【學(xué)位授予單位】：青海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S512.4
【圖文】：

花青素的結(jié)構(gòu)是 3,5,7-羥基-2-苯基苯并吡喃（圖1-1），根據(jù)花色素苷結(jié)構(gòu)中 R1 和 R2 碳位上的取代基不同，可獲得多種花青素。在自然界中有超過(guò) 250 種花青素，屬于 27 個(gè)科、73 個(gè)屬。有 6 種比較常見(jiàn)，即磚紅色天竺葵色素（Pelargonidin）、紅色矢車(chē)菊色素（Cyanidin）、紫紅色芍藥花色素（Peonidin）、藍(lán)色飛燕草色素（Delphinidin）、紫色牽牛花色素（Petunidin）和藍(lán)紫色錦葵色素（Malvidin）�；ㄇ嗨胤肿泳哂泄捕笮再|(zhì)并含有酸、堿基。它可以大幅度的吸收可見(jiàn)光與紫外光�；ㄇ嗨氐念伾S pH 值變化而變化，pH=7呈紅色，pH=7～8 時(shí)呈紫色，pH＞11 時(shí)呈藍(lán)色[6]。圖 1-1 花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure.1-1 Chemical structure of anthocyanins1.2.2 花青素的生物學(xué)功能植物葉片中積累的花青素通過(guò)理化特性來(lái)抵御光能危害

圖 2-1 黑飼麥 1 號(hào)(藍(lán))和 SHW31(白)種子 2-1 Seeds of Black fodder wheat No.1(Blue)and SHW31(Whi器、試劑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2717949