發(fā)布時間：2020-06-16 19:32

【摘要】：甘藍型油菜(Brassica napus L.)是我國重要的油料作物,不僅可生產食用油,而且其餅粕富含蛋白質,也可作為動物飼料。種子大小(千粒重)是產量的重要決定因素之一,尋找并研究控制種子大小的基因及其功能性SNPs對促進分子設計育種的發(fā)展、提高油菜籽產量具有深遠的意義。本研究基于具有324個油菜種質資源的自然群體,對甘藍型油菜生長調控因子家族(growth regulating-factors,GRFs)中的35個基因進行了千粒重的關聯(lián)分析,檢測到33個與種子千粒重顯著相關的SNPs位點,這些SNPs位點主要分布于BnaC02g44780D基因區(qū)域,由于它是生長調控因子7中的一個基因,我們將它命名為BnGRF7c。本研究以BnGRF7c為切入點,對其進行生物信息學分析、生物學特征分析、表達譜分析和功能驗證等方面的研究,本研究的主要結果如下:(1)本研究從具有324個油菜種質資源的自然群體中,分別選擇千粒重大的材料(4.17~5.52g)和千粒重小的材料(2.83~3.55g)作為分組,采用三種方法,即Fst(Fixation index)分析、θPi分析和Tajima’D分析,對BnGRF7c進行選擇壓力分析。結果顯示BnGRF7c在育種過程中受到了正選擇,推測其可能是油菜育種中一個至關重要的功能基因。組織特異性表達模式分析結果表明,BnGRF7c在油菜莖尖和發(fā)育中的種子中的表達水平較高,與關聯(lián)分析結果在一定程度上相吻合,證實BnGRF7c與種子發(fā)育有關。(2)構建了pK7FWG2.0-BnGRF7c-eGFP植物融合表達載體,利用農桿菌介導的煙草瞬時表達系統(tǒng)對BnGRF7c編碼的蛋白進行亞細胞定位分析,結果顯示BnGRF7c蛋白分布于煙草表皮細胞的細胞核中,與預測結果相一致,表明它在油菜的生長發(fā)育過程中以轉錄因子的身份發(fā)揮作用,調控油菜的生長,從而影響油菜的種子大小。(3)構建了pBI121-BnGRF7c過表達載體,通過農桿菌介導的浸花法遺傳轉化擬南芥,經篩選得到陽性的轉基因擬南芥植株。過表達植株表型調查結果表明,與野生型相比,其葉片面積、花瓣面積、角果長度和種子大小均明顯增加,證實BnGRF7c確實可以調控種子大小。為進一步驗證BnGRF7c基因的功能,使用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)對BnGRF7c基因進行敲除,然后利用下胚軸遺傳轉化體系將基因敲除載體BnGRF7c-Cas9轉化到甘藍型油菜中,并針對不同的油菜品種將轉化體系進行了相應優(yōu)化,經篩選鑒定已獲得陽性株,其功能有待于后續(xù)進一步驗證。研究結果表明,BnGRF7c蛋白定位于細胞核中,在油菜的生長發(fā)育過程中以轉錄調控因子的身份發(fā)揮作用,推測其可能以參與細胞分裂調控的方式來影響油菜的種子發(fā)育,從而調控油菜的種子大小。篩選到幾個在具有大種子的油菜種質中呈現(xiàn)較強規(guī)律性的SNPs位點,通過PCR反應程序優(yōu)化,檢測到SNP chrC02_random_566683位點可用于油菜分子設計育種中大量樣本的篩選。上述研究結果不僅揭示了植物轉錄調控因子與植物生長過程及種子發(fā)育之間的關系,為研究植物種子發(fā)育提供理論依據,同時對植物種子大小的遺傳改良、高產油菜品種的選育也具有重要的指導意義。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.4
【圖文】：

BnGRF7c 基因的功能研究及其 SNP 分子標記開發(fā)表 1.1 (續(xù))Table 1.1 (continued)途徑 蛋白名稱 物種名稱蛋白質類別 功能喪失的表型參考文獻HvDep1 大麥 G 蛋白 γ 亞基的同源基因 小谷粒[49]轉錄調控因子BS1 豆科 轉錄調節(jié)因子 大種子 [50]GW8 水稻 SBP 家族轉錄因子；OsSPL16 窄谷粒 [51]GS2 水稻 生長調控因子 4 小谷粒 [52;53]OsGIF1 水稻 GRF 互作蛋白 1 小谷粒 [54]SOD7 擬南芥 B3 結構域轉錄抑制因子 大種子 [53]NGAL3 擬南芥 B3 結構域轉錄抑制因子 大種子 [56]

般 Fst 值越大，表明兩個亞組分化越嚴重，從而說明該區(qū)域在兩個亞組中發(fā)生明顯分化，則該區(qū)域為種子大小的受選擇區(qū)域。(2) θPi 分析，窗口 20 kb，步長 2 kb，計算兩組材料的遺傳多樣性 Pi，如果兩組材料某個區(qū)域的 Pi 差異顯著，則比值會偏高或偏低，說明該區(qū)域受選擇。(3) Tajima’s D 分析，是基于群體中性進化的分析，窗口 20 kb，沒有步長，若Tajima’sD 值大于 0，顯示有很多中頻等位基因出現(xiàn)在這個窗口，可推測為平衡選擇；若 Tajima’sD 值小于 0，顯示有很多低頻等位基因出現(xiàn)在這個窗口，可推測為定向選擇。總之，Tajima’s D 值越偏離 0，受選擇程度越高。雖然三種分析方法的窗口均為 20 kb，而且其中 Tajima’s D 分析沒有步長，但是如圖 2.1 所示，BnGRF7c 基因上游 22 kb 及下游 8 kb 區(qū)域內無其他基因(來源于數(shù)據庫 GENOSCOPE)，因此可以排除干擾。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 夏天;李娜;李云海;;植物種子和器官大小調控研究取得新進展[J];遺傳;2013年10期

相關會議論文 前1條

1 夏天;李杰;李勝軍;李云海;;DA1和DA2協(xié)同調控植物種子和器官大小[A];2010全國植物生物學研討會論文集[C];2010年

相關碩士學位論文 前1條

1 王杰利;甘藍型油菜過量表達BnOLE引起種子和器官變大的研究[D];江蘇大學;2016年

本文編號：2716476