【摘要】：棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,也是世界第二大紡織纖維工業(yè)原料和食用油原料。隨著棉花基因工程和轉(zhuǎn)基因育種的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)基因育種成為棉花育種最為快捷高效的途徑。體細(xì)胞胚胎發(fā)生作為棉花再生體系的主要途徑,具有遺傳穩(wěn)定性好和嵌合體少的優(yōu)點(diǎn),體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的建立是棉花高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的基礎(chǔ)。近年來,不同基因型棉花再生體系相繼建立,對(duì)棉花體細(xì)胞胚胎再生體系的分子機(jī)制研究也越來越多。其中,生長(zhǎng)素和光在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控起著重要的作用,但生長(zhǎng)素和光的相互作用網(wǎng)絡(luò)及對(duì)棉花組培是否有積極的影響還不清楚。本研究利用擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系,鑒定出了低通量的紅光對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷的建成具有正調(diào)控作用。通過不同光處理觀察,鑒定出最優(yōu)的光組合體系并通過DR5:GUS:GFP以及pPIN1:PIN1:GFP分析紅光和生長(zhǎng)素的關(guān)系,并運(yùn)用至棉花組培中,得到以下試驗(yàn)結(jié)果:1.低通量的紅光影響擬南芥體胚發(fā)生的胚性愈傷的分化利用擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis,SE)體系來評(píng)價(jià)不同體細(xì)胞胚胎發(fā)生階段紅光的效果,初級(jí)體細(xì)胞胚(primary somatic embryo,PSE)誘導(dǎo)和胚性愈傷(disc-like embryonic calli,EC)誘導(dǎo)階段采用不同組合的光照,觀察并分別計(jì)算了EC誘導(dǎo)5天時(shí)的細(xì)胞分化率。結(jié)果表明在白光條件下誘導(dǎo)PSEs,紅光條件下進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)為最優(yōu)體系,其與黑暗相比,紅光處理下的EC誘導(dǎo)率明顯提高。2.紅光通過促進(jìn)胚性愈傷誘導(dǎo)過程中生長(zhǎng)素的積累和分布誘導(dǎo)胚性愈傷建成白光條件下初級(jí)體細(xì)胞胚胎被誘導(dǎo),胚性愈傷誘導(dǎo)分別在黑暗和紅光條件下誘導(dǎo)的體系被用來進(jìn)行該項(xiàng)研究。利用擬南芥DR5:GUS:GFP和pPIN1:PIN1:GFP轉(zhuǎn)基因材料來監(jiān)測(cè)胚性愈傷誘導(dǎo)階段不同光處理下的生長(zhǎng)素的含量及其分布情況。結(jié)果表明,在胚性愈傷誘導(dǎo)階段2-5天,相較于黑暗,紅光處理下的GFP和GUS的表達(dá)更明顯且分布更為廣泛。這說明紅光通過促進(jìn)生長(zhǎng)素的合成和分布促進(jìn)胚性愈傷的建成。3.低通量紅光應(yīng)用于棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生為了明確低通量紅光對(duì)棉花體細(xì)胞胚胎分化的影響,將低通量紅光設(shè)置在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的體系中進(jìn)行研究,結(jié)果表明,相較于對(duì)照(16h白光/8h黑暗),紅光(16h紅光/8h黑暗)作用于棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的愈傷誘導(dǎo)階段將很大程度提高胚性愈傷的分化效率。利用DR5:GFP轉(zhuǎn)基因棉花材料證明了紅光通過促進(jìn)生長(zhǎng)素的積累來加速胚性愈傷的建成,并且紅光對(duì)難分化材料中12的分化具有明顯的改善。這說明,紅光可應(yīng)用于棉花組培優(yōu)化體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系進(jìn)而輔助棉花遺傳轉(zhuǎn)化。綜上所述,低通量的紅光能夠顯著提高棉花胚性愈傷的誘導(dǎo)分化和改善難分化材料愈傷組織的誘導(dǎo),且與生長(zhǎng)素的積累分布密切相關(guān)。打破了由棉花愈傷組織向胚性愈傷分化效率低的瓶頸,為棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于品種選育奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

3 結(jié)果與分析 擬南芥和棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)觀察分析 擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生形態(tài)學(xué)觀察為了確立一個(gè)高效擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，本研究采用了蘇英華等改體系。剪取在擬南芥室培養(yǎng)至 5-6 周的擬南芥彎子葉胚（未成熟的合子胚植體（圖 1A），首先在初級(jí)胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上全光照條件下誘導(dǎo)初級(jí)胚，接，在苗端分生組織觀察到綠色的初級(jí)體細(xì)胞胚（圖 1B）。將初級(jí)胚轉(zhuǎn)入更,4-D 的液體培養(yǎng)基中在懸浮培養(yǎng)繼續(xù)誘導(dǎo)，培養(yǎng) 14 天后圓盤狀的胚性愈傷（圖 1C）。之后將胚性愈傷轉(zhuǎn)入不含激素的液體培養(yǎng)基中（B5 基礎(chǔ)培養(yǎng)基浮條件下繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng) 3-4 天時(shí)，子葉原基已經(jīng)形成，其形態(tài)和心形似，子葉原基之間形成莖尖分生組織（Stem apex meristem, SAM）（圖 1D培養(yǎng)至 8 天時(shí)，從胚性愈傷中誘導(dǎo)出具有胚軸、兩個(gè)明顯的子葉和莖尖分次級(jí)胚（圖 1E）。

隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，愈傷的狀態(tài)由早期愈傷（圖2C）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃谟鷤麪顟B(tài)（圖 2D），后期愈傷狀態(tài)蓬松，含水量豐富。將愈傷轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基（embryogenic callus induce medium, ECIM）上來誘導(dǎo)胚性愈傷（ECs）的形成。在 ECIM 上培養(yǎng)一段時(shí)間后，會(huì)誘導(dǎo)出大量米粒狀的ECs（圖 2-E）。接著將胚性愈傷轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基（embryo induce medium,EIM）上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚（SEs）的形成，根據(jù)體細(xì)胞胚發(fā)育狀態(tài)的不同，將體細(xì)胞胚分為球形胚（圖 2F）、心形胚（圖 2G）、魚雷胚（圖 2H）和子葉胚（圖 2I）。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S562

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本文編號(hào)：2710371