發(fā)布時(shí)間：2020-06-07 18:55

【摘要】：衰老是植物界普遍存在的一種自然現(xiàn)象,在植物整個(gè)生命周期中扮演著至關(guān)重要的角色,具有重要的生物學(xué)意義。植物在適應(yīng)外界環(huán)境的過程中,蛋白磷酸酶調(diào)控多個(gè)蛋白激酶的可逆磷酸化過程來使植物適應(yīng)外界環(huán)境。2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是一類廣泛存在于植物中的蛋白磷酸酶,通過脫磷酸化調(diào)控細(xì)胞的生長發(fā)育以及信號(hào)傳遞,從而調(diào)整體內(nèi)相關(guān)基因的變化來對(duì)抗逆境脅迫。在前期研究中篩選出兩個(gè)PP2C型蛋白磷酸酶編碼的水稻基因OsSAPP2、OsSAPP3,獲得相應(yīng)的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻,并獲得相應(yīng)的突變體。在本研究主要對(duì)水稻OsSAPP2和OsSAPP3功能進(jìn)行分析。1.蛋白定位本試驗(yàn)構(gòu)建了目標(biāo)蛋白與EGFP的融合蛋白瞬時(shí)表達(dá)載體。通過對(duì)水稻原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示OsSAPP2-GFP和OsSAPP3-GFP融合蛋白均定位于細(xì)胞膜上。2.OsSAPP2基因功能運(yùn)用GUS組織化學(xué)染色法對(duì)Pro_(OsSAPP2)-GUS轉(zhuǎn)基因植物中OsSAPP2啟動(dòng)子活性進(jìn)行時(shí)空表達(dá)模式分析。研究結(jié)果得出,OsSAPP2基因在轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時(shí)期的葉、根、穗、莖等植物組織部位中均有活性。本試驗(yàn)對(duì)OsSAPP2啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)其含有激素響應(yīng)元件,推測(cè)其可能響應(yīng)多種植物激素。試驗(yàn)結(jié)果也得出Pro_(OsSAPP2)-GUS轉(zhuǎn)基因水稻可以對(duì)外源激素處理發(fā)生響應(yīng),外源施加同樣濃度的ABA、ACC、SA和SL等激素可以顯著促進(jìn)Pro_(OsSAPP2)-GUS的表達(dá),而施加相同濃度的6-BA、IAA和GA_3等激素則顯著抑制Pro_(OsSAPP2)-GUS的表達(dá);而施加相同濃度的JA和BR的影響不明顯。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)35S-OsSAPP2轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出葉面積和有效分蘗減小、抽穗提前以及光合指標(biāo)和葉綠素含量降低,葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常,葉片比對(duì)照提前黃化早衰,葉綠素含量檢測(cè)結(jié)果與表型相對(duì)應(yīng)等早衰表型。還發(fā)現(xiàn)35S-OsSAPP2轉(zhuǎn)基因水稻的穗重顯著增加,但穗長顯著減少,一次枝梗和二次枝梗中枝梗數(shù)、實(shí)粒數(shù)以及實(shí)粒重增加、但同時(shí)秕粒也增加,結(jié)實(shí)率下降,種子的粒寬和粒長增加,千粒重增加。對(duì)35S-OsSAPP2轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行稻米品質(zhì)的測(cè)定得到的結(jié)果35S-OsSAPP2轉(zhuǎn)基因水稻在食味值和直鏈淀粉含量上要低于對(duì)照。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)過程中觀察到的早衰表型變化,利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的分子機(jī)制變化發(fā)現(xiàn),隨著水稻葉片的衰老35S-OsSAPP2轉(zhuǎn)基因水稻中衰老相關(guān)因子NAP基因和葉綠素降解相關(guān)基因PAO、NYC的表達(dá)量上調(diào),且隨著衰老的加劇表達(dá)量是升高的,光合作用相關(guān)基因PSaA、PSbA從抽穗期開始表達(dá)量下降。葉綠素合成相關(guān)基因CAO在蠟熟期時(shí)表達(dá)量降低。3.OsSAPP3基因功能經(jīng)過外源誘導(dǎo)后的GVG-OsSAPP3轉(zhuǎn)基因水稻同樣表現(xiàn)早衰表型:光合指標(biāo)降低,葉綠素含量降低、葉片比對(duì)照提前黃化早衰,葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常,葉綠素含量檢測(cè)結(jié)果與表型相對(duì)應(yīng)。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)過程中觀察到的早衰表型變化,利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的分子機(jī)制變化發(fā)現(xiàn),在經(jīng)過12h的DEX誘導(dǎo)的GVG-OsSAPP3轉(zhuǎn)基因水稻,衰老相關(guān)因子NAP基因和葉綠素降解相關(guān)基因PAO、NYC的表達(dá)量上調(diào),且隨著衰老的加劇表達(dá)量是上升的,光合作用相關(guān)基因PSaA、PSbA和葉綠素合成相關(guān)基因CAO表達(dá)量下調(diào),且隨著衰老的加劇表達(dá)量是下降的。4.突變體鑒定、表型分析將所獲得OsSAPP2基因的突變體水稻種子進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OsSAPP2基因的突變體水稻單株均為T-DNA雜合插入。田間表型觀察發(fā)現(xiàn),在分蘗期開始,OsSAPP2基因的突變體水稻的分蘗少,在完熟期OsSAPP2基因的突變體水稻大部分葉片還是綠色未衰老的狀態(tài)。綜合以上本文研究結(jié)果,我們認(rèn)為過表達(dá)OsSAPP2和OsSAPP3基因可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻葉片發(fā)生一系列的早衰表型,參與植物葉片衰老的調(diào)控,是正向調(diào)節(jié)因子。
【圖文】：

圖 1 OsSAPP2 蛋白的亞細(xì)胞定位A：左到右分別為熒光通道、明場(chǎng)、疊加圖；B：左到右分別為 35S-OsSAPP2-GFP 蛋白熒光通道、明場(chǎng)、疊加圖。（Bar=10μm）Fig1 Subcellular localization of OsSAPP2 proteinA: Left to right are GFP、Bright、Merged;B: Left to right are 35S-OsSAPP2-GFP protein GFP、Bright、Merged. (Bar=10μm)2.3.2 35S-OsSAPP2 轉(zhuǎn)基因植株純合篩選選取已經(jīng)在前期實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過目的基因表達(dá)水平檢測(cè)的 35S-OsSAPP2 轉(zhuǎn)基因水稻，確定其為超表達(dá)株系：line1、line8、line48、line58 的 T2代種子和 SN9816 種子各 50 粒經(jīng)過催芽后播種于苗床中。在苗床上培養(yǎng)三周左右，分別隨機(jī)選取 30 棵 35S-OsSAPP2 轉(zhuǎn)基因水稻苗提取其總 DNA，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，以 SN9816 的 DNA 和水為陰性對(duì)照。部分結(jié)果顯示（圖 2）：line1、line8、line48、line58 所進(jìn)行檢測(cè)的 30 株苗在 500bp時(shí)均有目的片段，確定其均為陽性植株。并經(jīng)過兩年的的篩選與檢測(cè)，確定 line1、line8、line48、line58 四個(gè)株系為純合株系，選取 20 株苗每四株插于一個(gè)盆栽桶中，并對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

圖 1 OsSAPP2 蛋白的亞細(xì)胞定位A：左到右分別為熒光通道、明場(chǎng)、疊加圖；B：左到右分別為 35S-OsSAPP2-GFP 蛋白熒光通道、明場(chǎng)、疊加圖。（Bar=10μm）Fig1 Subcellular localization of OsSAPP2 proteinA: Left to right are GFP、Bright、Merged;B: Left to right are 35S-OsSAPP2-GFP protein GFP、Bright、Merged. (Bar=10μm)2.3.2 35S-OsSAPP2 轉(zhuǎn)基因植株純合篩選選取已經(jīng)在前期實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過目的基因表達(dá)水平檢測(cè)的 35S-OsSAPP2 轉(zhuǎn)基因水稻，確定其為超表達(dá)株系：line1、line8、line48、line58 的 T2代種子和 SN9816 種子各 50 粒經(jīng)過催芽后播種于苗床中。在苗床上培養(yǎng)三周左右，分別隨機(jī)選取 30 棵 35S-OsSAPP2 轉(zhuǎn)基因水稻苗提取其總 DNA，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，以 SN9816 的 DNA 和水為陰性對(duì)照。部分結(jié)果顯示（圖 2）：line1、line8、line48、line58 所進(jìn)行檢測(cè)的 30 株苗在 500bp時(shí)均有目的片段，確定其均為陽性植株。并經(jīng)過兩年的的篩選與檢測(cè)，確定 line1、line8、line48、line58 四個(gè)株系為純合株系，選取 20 株苗每四株插于一個(gè)盆栽桶中，，并對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S511

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本文編號(hào)：2701856