【摘要】：中國(guó)是一個(gè)歷史悠久的農(nóng)業(yè)大國(guó),水稻作為主要的糧食作物,解決了近14億人口的溫飽問題。低溫冷害是一種常見的氣象災(zāi)害,嚴(yán)重影響了稻作的生產(chǎn),在東北地區(qū)尤其普遍,受到低溫冷害的影響較為頻繁,多為障礙性冷害,給水稻產(chǎn)量造成巨大損失。障礙性冷害每4-5年就會(huì)發(fā)生一次較嚴(yán)重的災(zāi)害,嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)。為解決這一矛盾,就需要提高水稻品種的耐冷性。所以我們要克隆耐障礙性冷害基因并利用它培育耐冷品種。本研究前期通過水稻耐寒?dāng)?shù)字表達(dá)譜,篩選出一個(gè)與光合作用相關(guān)且在低溫處理下表達(dá)量明顯上調(diào)的基因,確定耐冷候選基因OsRBCS3為研究對(duì)象。本研究對(duì)這個(gè)基因的CDS區(qū)克隆以后,進(jìn)行序列差異比對(duì),發(fā)現(xiàn)L11和K131中二者CDS區(qū)沒有差別,同時(shí)在低溫脅迫下發(fā)現(xiàn)二者目的基因表達(dá)量明顯不同,我們便認(rèn)為該基因的表達(dá)量影響了兩個(gè)品種的耐冷性。它超表達(dá)就耐冷。為了證明這個(gè)觀點(diǎn),一方面根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的OsRBCS3基因過表達(dá)材料L-12、L-18品系,利用分子手段篩選其后代陽(yáng)性株系,驗(yàn)證目的基因超表達(dá)以后是否提高了耐冷性;另一方面利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造K131中目的基因敲除的品系,驗(yàn)證目的基因沉默表達(dá)后耐冷性是否降低。如果假設(shè)成立,就說明這個(gè)基因表達(dá)量增加耐障礙性冷害能力就增加了。主要研究結(jié)果如下:1、確定了轉(zhuǎn)基因苗期潮霉素篩選的篩選劑的最佳篩選濃度為15mg/L。利用該濃度篩選T_1代株系抗潮霉素的表型,共獲得11個(gè)株系表型為抗性的幼苗,經(jīng)過外源基因PCR鑒定,這11個(gè)株系中有60個(gè)單株為陽(yáng)性結(jié)果,陽(yáng)性得率為100%。其中材料L-12為6個(gè),每個(gè)材料4~6株共33株,材料L-18為5個(gè),每個(gè)材料4~6株共27株。2、取這11個(gè)株系的T_0代部分種子,用潮霉素抗性培養(yǎng)基篩選T_1代幼苗,不同株系對(duì)潮霉素抗性產(chǎn)生不同的分離比,其中,在T_1代中10個(gè)株系的分離比約為3:1,遵循孟德爾遺傳模式。說明外源基因是單拷貝插入,且為單基因顯性遺傳。也有1株系的分離比低于3:1,不符合孟德爾遺傳法則。3、收獲這10個(gè)株系種子即T_2代,每個(gè)株系取部分幼苗進(jìn)行hpt-PCR擴(kuò)增,檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段大小為472bp,且全部為陽(yáng)性。篩選出10個(gè)陽(yáng)性過表達(dá)株系。分別是L-12為5個(gè)株系,L-18為5個(gè)株系。4、將OsRBCS3基因從耐冷水稻空育131中克隆出來,利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除載體,利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化空育131,獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系CL為24株,通過分子檢測(cè)和測(cè)序鑒定靶位點(diǎn)發(fā)生編輯的突變株系為18株,通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),其中5/18株由于靶位點(diǎn)的修飾方式為堿基的插入而引發(fā)移碼突變,提前產(chǎn)生終止密碼子,翻譯提前終止。5、對(duì)過表達(dá)材料和基因敲除材料分別進(jìn)行進(jìn)行孕穗期耐冷性指標(biāo)鑒定,苗期耐冷性指標(biāo)鑒定和real-time PCR檢測(cè),結(jié)果表明,利用Gataway技術(shù)獲得的OsRBCS3基因超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系L-12和L-18的耐冷性和目的基因的表達(dá)量較野生型有明顯的提高;相反,利用CRISPR/Cas9法編輯的耐冷OsRBCS3基因的突變體CL的耐冷性和目的基因的表達(dá)量較野生型有明顯的下降。6、對(duì)過表達(dá)材料、基因敲除材料在低溫冷害下進(jìn)行生理指標(biāo)的檢測(cè),結(jié)果顯示:過表達(dá)植株在低溫處理下Rubisco酶活性較野生型有所提高;敲除材料低溫處理下Rubisco酶活性較野生型有明顯下降。相反,在低溫處理下丙二醛的含量,在過表達(dá)材料中MDA含量低于野生型材料,敲除材料MDA含量高于野生型材料。
【圖文】：

2.1 試驗(yàn)材料2.1.1 水稻材料轉(zhuǎn)基因受體材料：耐冷粳稻品種空育 131（K131）、冷敏感粳稻品種龍粳 1（L11），由黑龍江大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。轉(zhuǎn)基因材料：L-12、L-18 和CL 品系由本研究培育創(chuàng)造的。2.1.2 供試菌株與載體菌株：EHA105 農(nóng)桿菌，，由黑龍江大學(xué)生分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DH5大腸桿菌（購(gòu)自天根公司）。載體：過表達(dá)載體 pGWB12-R3、過表達(dá)載體 pGWB18-R3、水稻 OsRBCS3 因 CRISPR/Cas9 敲除載體 PVK-R3 是本研究構(gòu)建。

OsRBCS1~OsRBCS5 上下游引物，并擴(kuò)增與 OsRBCS3 基因的靶位點(diǎn)附近區(qū)域片段。OsRBCS1 基因引物 OsRBCS1-F/OsRBCS1-R（見表 2-1）能擴(kuò)增出 912bp 的特異條帶； OsRBCS2 基因引物 OsRBCS2-F/OsRBCS2-R（見表 2-1）能擴(kuò)增出 680bp 的特異條帶；OsRBCS4 基因引物 OsRBCS4-F/OsRBCS4-R（見表 2-1）能擴(kuò)增出 659bp的特異條帶；OsRBCS5 基因引物 OsRBCS5-F/OsRBCS5-R（見表 2-1）能擴(kuò)增出681bp 的特異條帶。OsRBCS3 基因家族間靶位點(diǎn)的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除 OsRBCS3基因外，家族間基因均有 4-14 個(gè)不等的堿基差異。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S511

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本文編號(hào)：2697401