發(fā)布時間：2020-06-02 04:31

【摘要】：蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)屬小麥族的二倍體多年生牧草,抗旱性極強,在我國北方干旱草原及半荒漠地區(qū)天然草場補播改良和旱作人工草地建植中占有重要位置,且蘊含麥類作物遺傳改良的寶貴基因資源。microRNA是植物體內(nèi)普遍存在的非編碼RNA,參與調(diào)控干旱、鹽害、寒冷等多種逆境脅迫響應(yīng)。針對蒙古冰草抗旱相關(guān)miRNA這一研究的空白,本試驗構(gòu)建干旱脅迫下蒙古冰草small RNA文庫,通過Solexa高通量測序及生物信息學(xué)分析篩選與抗旱顯著相關(guān)的miRNA;利用stem-loop real-time PCR技術(shù)對7個抗旱相關(guān)的miRNA進(jìn)行定量驗證,并利用Target Finder軟件和psRNATarget數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因預(yù)測;構(gòu)建miRNA的過表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬南芥,驗證miRNA的抗旱功能,這為深入研究蒙古冰草miRNA抗旱分子機制及牧草分子育種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、蒙古冰草中共篩選得到114個新miRNA,其中保守的53個、非保守的61個,差異表達(dá)的有17個。2、蒙古冰草中7個差異表達(dá)的miRNA在蒙古冰草中預(yù)測到17個靶基因,在擬南芥中預(yù)測到60個靶基因,大多參與干旱逆境脅迫響應(yīng)。3、蒙古冰草7個miRNA在對照和干旱處理的情況下,amo-miR21、amo-miR62、amo-miR82、amo-miR5和amo-miR77的表達(dá)量隨著干旱時間的延長均呈上調(diào)趨勢,而amo-miR44與amo-miR17的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢,與測序結(jié)果一致。4、成功構(gòu)建蒙古冰草7個miRNA的表達(dá)載體:pBI121-amo-miR21、pBI121-amo-miR5、pBI121-amo-miR62、pBI121-amo-miR44、pBI121-amo-miR82、pBI121-amo-miR17和pBI121-amo-miR7。5、得到了轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性植株,蒙古冰草3個抗旱相關(guān)miRNA(amo-miR21、amo-miR5、amo-miR62)可穩(wěn)定遺傳,且調(diào)控表達(dá)趨勢與蒙古冰草中相同。
【圖文】：

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文核內(nèi)，被 DCL1（Dicer-like1）等酶剪切為發(fā)卡狀的 pre- Hasty（HST）和其他的一些蛋白因子的作用下被轉(zhuǎn)運到切作用下形成 miRNA/miRNA*復(fù)合體，隨后在 HEN1 等RNA；成熟的 miRNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced sile的靶 mRNA 結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[38-41]。

為起始樣品，small RNA的3’端加上接頭，添加反轉(zhuǎn)錄引物，然后加5’接頭，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后經(jīng)過PCR擴增，PAGE膠電泳分離目標(biāo)片段，切膠回收得到的即為cDNA文庫（圖2）。圖 2 文庫構(gòu)建原理圖Fig.2 The principle diagram of library construction文庫建成后，用Qubit2.0初步定量，稀釋文庫至2ng/ul，對文庫進(jìn)行insert size檢測，用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度＞2nM），，以保證文庫
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S543.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2692612