【摘要】：干旱脅迫是制約我國甘藍(lán)型油菜生產(chǎn)的重要非生物脅迫。甘藍(lán)型油菜在整個(gè)生長期間需水量大,對(duì)干旱的適應(yīng)性差,因此選育耐旱的新品種對(duì)油菜增質(zhì)增產(chǎn)就顯得非常重要。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)主要是通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的,miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而參與調(diào)控植株生長發(fā)育和對(duì)各種非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。本研究鑒定了一種在PEG模擬干旱脅迫下顯著誘導(dǎo)表達(dá)的Bna-miR845,它可能參與甘藍(lán)型油菜應(yīng)答干旱脅迫的調(diào)控過程。之后,為了驗(yàn)證其功能,我們又利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系,探究過表達(dá)Bna-miR845的陽性株系在干旱脅迫下的生理生化變化和耐旱的分子機(jī)制,主要的研究結(jié)果如下:1.通過northern blot實(shí)驗(yàn),證實(shí)Bna-miR845為前體序列100 bp,成熟序列為20 bp的miRNA,通過5'-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BnATP9為其靶基因之一。2.對(duì)甘藍(lán)型油菜種植品種進(jìn)行PEG模擬干旱處理,取其葉片進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)干旱處理后Bna-miR845出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)。結(jié)果說明,miR845受到干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),可能參與了植物響應(yīng)干旱脅迫的應(yīng)答過程。3.對(duì)Bna-miR845在甘藍(lán)型油菜不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Bna-miR845在葉、根、花苞、花和角果中的表達(dá)量均比較高,其靶基因BnATP9在葉、根、花苞、花和角果中的表達(dá)都較高,表明Bna-miR845可能在甘藍(lán)型油菜發(fā)育的不同時(shí)期和組織中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。利用煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)靶基因BnATP9的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞質(zhì)中。4.構(gòu)建了 Bna-miR845及其靶基因BnATP9的過表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得了陽性植株。對(duì)野生型和Bna-miR845過表達(dá)株系T2代植株進(jìn)行ABA處理,發(fā)現(xiàn)ABA處理后Bna-miR845過表達(dá)植株的根長顯著長于野生型植株。qPCR分析發(fā)現(xiàn)Bna-miR845出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá),靶基因BnATP9顯著下調(diào)表達(dá),說明Bna-miR845受ABA誘導(dǎo)表達(dá),負(fù)調(diào)控BATP9。5.對(duì)Bna-miR845過表達(dá)植株和野生型植株同時(shí)進(jìn)行干旱處理,并對(duì)處理前后植株中的各項(xiàng)生理指標(biāo)以及基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果顯示,Bna-miR845過表達(dá)植株中RWC,POD、SOD活性和Pro含量都高于野生型,而MDA含量和REC則相反,顯著小于對(duì)照。說明Bna-miR845過表達(dá)植株在干旱脅迫下,通過更加積極的調(diào)動(dòng)植株體內(nèi)過氧化物保護(hù)酶活性,增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的生物合成等途徑來減小干旱脅迫所造成的損傷。qPCR分析發(fā)現(xiàn),干旱處理后Bna-miR845過表達(dá)植株和野生型植株中Bna-miR845的表達(dá)量逐漸升高,且Bna-miR845過表達(dá)植株中Bna-miR845的表達(dá)量相較于干旱處理前比高于野生型植株高出更多。靶基因BnATP9在野生型植株中表達(dá)顯著下調(diào),而在Bna-miR845過表達(dá)植株中的表達(dá)幾乎完全被抑制。結(jié)果說明,Bna-miR845可能受到干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),從而調(diào)控靶基因BnATP9,抑制其表達(dá)。6.對(duì)Bna-miR845過表達(dá)植株和野生型植株葉片的氣孔進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,Bna-miR845過表達(dá)植株無論是上表皮還是下表皮上的氣孔密度都出現(xiàn)顯著減少。對(duì)其中氣孔發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控氣孔發(fā)育的基因TMM,ER,ERL1和ERL2均表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá),而正調(diào)控氣孔發(fā)育的基因SPCH和MUTE表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá),這與葉片上氣孔的密度顯著減少的現(xiàn)象是一致的。這就說明Bna-miR845過表達(dá)植株還可能通過降低氣孔密度,減少葉片水份蒸騰從而增強(qiáng)了油菜對(duì)缺水的耐受性。綜上所述,甘藍(lán)型油菜Bna-miR845過表達(dá)植株在干旱脅迫下,一方面可通過調(diào)節(jié)其ROS清除系統(tǒng)的活性來減少M(fèi)DA的積累,另一方面還可以通過減少其氣孔的數(shù)量和密度,來減少水分的散失,從而表現(xiàn)出更好的抗旱性。
【圖文】：

ＰＥＧ６０００脅迫后Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５的表達(dá)量均顯著上調(diào)，脅迫第２４邋ｈ相比第０邋ｈ表達(dá)量上調(diào)５逡逑倍以上，脅迫第４８邋ｈ表達(dá)量上調(diào)了邋１５倍以上，結(jié)果說明Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５在“甲９７１２”和“揚(yáng)逡逑９”這兩個(gè)種植品種中確實(shí)受到ＰＥＧ脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)（圖３．３）。逡逑２0＂｜邋■，．甲邋９７１２＂逡逑0邐口邋”揚(yáng)９”邐Ａ邋Ｉ逡逑ｗ邋１５－邐■逡逑卜」ｎｌｌ逡逑ｖ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑＇Ｏ邐？＊0邐＇Ｏ逡逑圖３．３野生型植株受到ＰＥＧ脅迫后Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５的表達(dá)分析逡逑

取甘藍(lán)型油菜不同發(fā)育時(shí)期的不同組織或器官，進(jìn)行ＲＮＡ的提取，，并對(duì)逡逑Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯不，Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５在葉、根、花荀、花和角果中逡逑的表達(dá)量均比較高（圖３．２），這也就表明Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５可能在甘藍(lán)型油菜發(fā)育的不逡逑同時(shí)期和不同組織中均可能發(fā)揮一定的調(diào)控作用。逡逑Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５逡逑ｉｌｙｉＬ逡逑圖３．４Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５在油菜不同組織中的表達(dá)分析逡逑Ｆｉｇ邋．邋３．４邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｎａｐｕｓ逡逑３．４邐Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５靶基因在甘藍(lán)型油菜不同組織中的表達(dá)分析逡逑根據(jù)５’－ＲＬＭ－ＲＡＣＥ的結(jié)果，確定他４７Ｐ９為Ｂｎａ－ｍｉＲ８４５的靶基因，并對(duì)它在不同組逡逑織的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定分析，從定量結(jié)果（圖３．４）來看，扮在種子中的表達(dá)量最高，逡逑葉、根、花、花苞和角果中的表達(dá)量次之。說明在甘藍(lán)型油菜的生長發(fā)育進(jìn)程可逡逑能也發(fā)揮著重要作用。逡逑ＢｎＡＴＰ９逡逑ｊ邋■ｌｉｉ．ｍｉｌ逡逑ｕ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑0°逡逑ｙ逡逑圖３．５邐在油菜不同組織中的表達(dá)分析逡逑Ｆｉｇ．邋３．５邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＢｎＡＴＰ９邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ．邋ｎａｐｕｓ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S565.4

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1 肖玉月;甘藍(lán)型油菜Bna-miR845在響應(yīng)干旱脅迫中的功能研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2691279