【摘要】：花生(Arachis hypogasa)是我國重要的油料作物。隨著土壤鹽漬化的加劇,我國可利用耕作面積不斷減少,而為了不與糧爭地,在鹽堿地種植花生已成為一個新的農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢。由于鹽漬土中的鹽脅迫通常會對植物造成離子毒害、滲透壓失衡以及氧化損傷,這對花生的高產(chǎn)和品質(zhì)產(chǎn)生了很大的威脅。根系是植物最先感受鹽脅迫的部位,花生萌發(fā)期根系發(fā)育是否良好直接影響花生后期的生長與產(chǎn)量。因此,研究花生萌發(fā)期根系的耐鹽機(jī)制,對于花生在鹽漬土中的種植有重要的參考意義。植物親環(huán)素(Cyclophilin)屬于一類多基因的高度保守的蛋白家族,具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性。大量研究表明,親環(huán)素在多種植物響應(yīng)高鹽、干旱、熱、冷、強(qiáng)光等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用,但目前為止,還沒有關(guān)于花生親環(huán)素AhCYP在耐鹽方面的研究。本研究以“花育22”花生萌發(fā)期根系為材料,獲得AhCYP的全長序列,構(gòu)建過表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將AhCYP轉(zhuǎn)入野生型煙草,并對轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性進(jìn)行評價。此外,本研究通過對150 mM NaCl脅迫下的花生萌發(fā)期根系施以5 mM EGTA、0.05 mM CPZ以及2 mM LaCl3來研究鈣離子信號在花生萌發(fā)期根系鹽脅迫響應(yīng)中的作用。主要結(jié)果如下:1.花生親環(huán)素AhCYP在鹽脅迫下的功能研究從“花育22”的cDNA中擴(kuò)增出AhCYP的基因序列,該基因的開放閱讀框長519 bp,能編碼172個氨基酸。AhCYP屬于親水性蛋白,無信號肽,不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,含有17個磷酸化位點(diǎn),其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲與α螺旋為主。此外,AhCYP啟動子的調(diào)控區(qū)域包含有與激素響應(yīng)、光響應(yīng)、參與植物逆境和防御基因激活等相關(guān)的元件。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),AhCYP與棉花GhCYP1的親緣關(guān)系較近。亞細(xì)胞定位研究證實(shí)AhCYP定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用qRT-PCR的方法對脅迫下的花生萌發(fā)期根系中的AhCYP的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AhCYP在鹽脅迫下被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),在3 h時表達(dá)量最高;jAhCYP在滲透脅迫、氧化脅迫初期先上調(diào)表達(dá),隨后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。由以上結(jié)果表明,AhCYP對于不同的非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制存在差異。對轉(zhuǎn)AhCYP煙草進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在正常生長條件下,轉(zhuǎn)基因煙草植株生長發(fā)育良好、結(jié)籽多。表型實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)AhCYP煙草對NaCl、Mannitol、MV表現(xiàn)出抗性。鹽脅迫下,轉(zhuǎn)AhCYP煙草的萌發(fā)率、根系活力、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及SOD、CAT等抗氧化酶活性顯著高于野生型,而相對電導(dǎo)率、MDA含量以及ROS的積累則顯著低于野生型煙草。由以上結(jié)果表明,過表達(dá)AhCYP能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。2.鈣離子信號在花生萌發(fā)期根系鹽脅迫響應(yīng)中的功能研究鹽脅迫對花生萌發(fā)期根系的抑制作用主要表現(xiàn)在抑制主根伸長和側(cè)根生長、降低根系活力、增加ROS的積累、加重膜脂過氧化以及降低抗氧化酶的活性等方面。而在鹽處理后施加鈣信號抑制劑,花生萌發(fā)期根系呈短細(xì)狀并出現(xiàn)褐化。與單獨(dú)鹽脅迫相比,花生萌發(fā)期根系中的抗氧化酶活性降低,造成根系中ROS的過量積累,引起根系細(xì)胞膜的氧化損傷。鈣信號抑制劑抑制抗氧化酶活性,從側(cè)面反映出鈣信號通路可能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性在植物鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。鈣信號抑制劑抑制了AhCaM、AhCBL1、AhCDPK、AhCNGC15的表達(dá)。同時,對與鹽脅迫相關(guān)的AhNHX3、AhNHX8、AhCYP、AhARF2、AhARF9等的表達(dá)也起抑制作用,進(jìn)而推測鈣信號通路可能通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來響應(yīng)鹽脅迫。此外,鈣信號抑制劑抑制鹽脅迫下ABA合成相關(guān)基因AhAO1、AhABA2、AhNCED1的表達(dá),阻礙了ABA的生物合成,影響了ABA依賴的信號通路在花生萌發(fā)期根系鹽脅迫響應(yīng)中的作用,而這暗示了鈣信號通路可能與ABA信號通路共同調(diào)控花生萌發(fā)期根系對鹽脅迫的響應(yīng)。
【圖文】：

有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性（ＰｐｉＢ），其結(jié)構(gòu)域共有１５２個氨基酸組成。ＡｈＣＹＰ逡逑也是親環(huán)素型肽基脯氨酸順反式異構(gòu)酶（Ｐｍ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），其結(jié)構(gòu)域共有１６４個逡逑氨基酸組成（圖２－２Ａ）。ＳＭＡＲＴ分析結(jié)果顯示，ＡｈＣＹＰ具有Ｐｒｏ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，逡逑與邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ邋分析結(jié)果一致（圖邋２－２Ｂ）。逡逑Ａ逡逑９邐Ｕ邐？邐ＩＭ邐Ｕｌ邐ＩＭ邐ｉｎ逡逑？Ｋｉｒｉｃ邋ｈｉ＊ｉ逡逑ＰｐｌＢ逡逑Ｐｒｏ＿ｉａｏ？？ｒａＢ0逡逑＾ｉ，Ｕ邐叩０００６０逡逑３ｗ＊ｒｒ？？ｉｌｉｎ邐ｃｕｃｌｅｔｉｈｉＵｎ邋ｓｔ＾ｗｒｆａａｉｌｕ逡逑Ｂ逡逑？■Ｐｒｏｌｉｓｏｍｅｒａｓｅ邋｜逡逑０邋＇１００逡逑圖２－２邋ＡｈＣＹＰ含有的保守蛋白結(jié)構(gòu)域逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｉｎ邋ＡｈＣＹＰ逡逑２．２．１．３邐ＡｈＣＹＰ的理化性質(zhì)分析逡逑利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ對ＡｈＣＹＰ的一級結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，逡逑ＡｈＣＹＰ的相對分子質(zhì)量為１８．４邋ｋＤａ，邋ｐｉ為７．７０，其理論半衰期為３０邋ｈ。因其不逡逑穩(wěn)定性指數(shù)為１８．７５

ＡＡＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＯＡＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＩＧＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧ大逡逑ＣＴＧＣＧＯＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＡＧ逡逑圖２－１邋ＯＲＦｆｍｄｅｒ的分析結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ逡逑２．２．１．２邐ＡｈＣＹＰ的結(jié)構(gòu)域分析逡逑通過ＮＣＢＩ在線網(wǎng)站中的Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ對ＡｈＣＹＰ蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域逡逑進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＡｈＣＹＰ屬于親環(huán)素超家族（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ邋ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ），具逡逑有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性（ＰｐｉＢ），其結(jié)構(gòu)域共有１５２個氨基酸組成。ＡｈＣＹＰ逡逑也是親環(huán)素型肽基脯氨酸順反式異構(gòu)酶（Ｐｍ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），其結(jié)構(gòu)域共有１６４個逡逑氨基酸組成（圖２－２Ａ）。ＳＭＡＲＴ分析結(jié)果顯示，，ＡｈＣＹＰ具有Ｐｒｏ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，逡逑與邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ邋分析結(jié)果一致（圖邋２－２Ｂ）。逡逑Ａ逡逑９邐Ｕ邐？邐ＩＭ邐Ｕｌ邐ＩＭ邐ｉｎ逡逑？Ｋｉｒｉｃ邋ｈｉ＊ｉ逡逑ＰｐｌＢ逡逑Ｐｒｏ＿ｉａｏ？？ｒａＢ0逡逑＾ｉ，Ｕ邐叩０００６０逡逑３ｗ＊ｒｒ？？ｉｌｉｎ邐ｃｕｃｌｅｔｉｈｉＵｎ邋ｓｔ＾ｗｒｆａａｉｌｕ逡逑Ｂ逡逑？■Ｐｒｏｌｉｓｏｍｅｒａｓｅ邋｜逡逑０邋＇１００逡逑圖２－２邋ＡｈＣＹＰ含有的保守蛋白結(jié)構(gòu)域逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｉｎ邋ＡｈＣＹＰ逡逑２．２．１．３邐ＡｈＣＹＰ的理化性質(zhì)分析逡逑利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ對ＡｈＣＹＰ的一級結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，逡逑ＡｈＣＹＰ的相對分子質(zhì)量為１８．４邋ｋＤａ
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S565.2

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本文編號：2678700