【摘要】：花生(Arachis hypogasa)是我國重要的油料作物。隨著土壤鹽漬化的加劇,我國可利用耕作面積不斷減少,而為了不與糧爭地,在鹽堿地種植花生已成為一個新的農業(yè)發(fā)展趨勢。由于鹽漬土中的鹽脅迫通常會對植物造成離子毒害、滲透壓失衡以及氧化損傷,這對花生的高產和品質產生了很大的威脅。根系是植物最先感受鹽脅迫的部位,花生萌發(fā)期根系發(fā)育是否良好直接影響花生后期的生長與產量。因此,研究花生萌發(fā)期根系的耐鹽機制,對于花生在鹽漬土中的種植有重要的參考意義。植物親環(huán)素(Cyclophilin)屬于一類多基因的高度保守的蛋白家族,具有肽基脯氨酰順反異構酶活性。大量研究表明,親環(huán)素在多種植物響應高鹽、干旱、熱、冷、強光等非生物脅迫中發(fā)揮重要作用,但目前為止,還沒有關于花生親環(huán)素AhCYP在耐鹽方面的研究。本研究以“花育22”花生萌發(fā)期根系為材料,獲得AhCYP的全長序列,構建過表達載體,利用農桿菌介導的方法將AhCYP轉入野生型煙草,并對轉基因煙草的耐鹽性進行評價。此外,本研究通過對150 mM NaCl脅迫下的花生萌發(fā)期根系施以5 mM EGTA、0.05 mM CPZ以及2 mM LaCl3來研究鈣離子信號在花生萌發(fā)期根系鹽脅迫響應中的作用。主要結果如下:1.花生親環(huán)素AhCYP在鹽脅迫下的功能研究從“花育22”的cDNA中擴增出AhCYP的基因序列,該基因的開放閱讀框長519 bp,能編碼172個氨基酸。AhCYP屬于親水性蛋白,無信號肽,不存在跨膜結構域,含有17個磷酸化位點,其二級結構主要以無規(guī)則卷曲與α螺旋為主。此外,AhCYP啟動子的調控區(qū)域包含有與激素響應、光響應、參與植物逆境和防御基因激活等相關的元件。進化分析發(fā)現,AhCYP與棉花GhCYP1的親緣關系較近。亞細胞定位研究證實AhCYP定位于細胞質中。利用qRT-PCR的方法對脅迫下的花生萌發(fā)期根系中的AhCYP的表達模式進行分析,結果發(fā)現AhCYP在鹽脅迫下被誘導上調表達,在3 h時表達量最高;jAhCYP在滲透脅迫、氧化脅迫初期先上調表達,隨后呈現下調表達。由以上結果表明,AhCYP對于不同的非生物脅迫的響應機制存在差異。對轉AhCYP煙草進行分析發(fā)現,在正常生長條件下,轉基因煙草植株生長發(fā)育良好、結籽多。表型實驗表明,轉AhCYP煙草對NaCl、Mannitol、MV表現出抗性。鹽脅迫下,轉AhCYP煙草的萌發(fā)率、根系活力、滲透調節(jié)物質含量以及SOD、CAT等抗氧化酶活性顯著高于野生型,而相對電導率、MDA含量以及ROS的積累則顯著低于野生型煙草。由以上結果表明,過表達AhCYP能提高轉基因煙草的耐鹽性。2.鈣離子信號在花生萌發(fā)期根系鹽脅迫響應中的功能研究鹽脅迫對花生萌發(fā)期根系的抑制作用主要表現在抑制主根伸長和側根生長、降低根系活力、增加ROS的積累、加重膜脂過氧化以及降低抗氧化酶的活性等方面。而在鹽處理后施加鈣信號抑制劑,花生萌發(fā)期根系呈短細狀并出現褐化。與單獨鹽脅迫相比,花生萌發(fā)期根系中的抗氧化酶活性降低,造成根系中ROS的過量積累,引起根系細胞膜的氧化損傷。鈣信號抑制劑抑制抗氧化酶活性,從側面反映出鈣信號通路可能通過調節(jié)抗氧化酶的活性在植物鹽脅迫響應中發(fā)揮作用。鈣信號抑制劑抑制了AhCaM、AhCBL1、AhCDPK、AhCNGC15的表達。同時,對與鹽脅迫相關的AhNHX3、AhNHX8、AhCYP、AhARF2、AhARF9等的表達也起抑制作用,進而推測鈣信號通路可能通過調控脅迫相關基因的表達來響應鹽脅迫。此外,鈣信號抑制劑抑制鹽脅迫下ABA合成相關基因AhAO1、AhABA2、AhNCED1的表達,阻礙了ABA的生物合成,影響了ABA依賴的信號通路在花生萌發(fā)期根系鹽脅迫響應中的作用,而這暗示了鈣信號通路可能與ABA信號通路共同調控花生萌發(fā)期根系對鹽脅迫的響應。
【圖文】：

有肽基脯氨酸順反異構酶活性（ＰｐｉＢ），其結構域共有１５２個氨基酸組成。ＡｈＣＹＰ逡逑也是親環(huán)素型肽基脯氨酸順反式異構酶（Ｐｍ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），其結構域共有１６４個逡逑氨基酸組成（圖２－２Ａ）。ＳＭＡＲＴ分析結果顯示，ＡｈＣＹＰ具有Ｐｒｏ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，逡逑與邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ邋分析結果一致（圖邋２－２Ｂ）。逡逑Ａ逡逑９邐Ｕ邐？邐ＩＭ邐Ｕｌ邐ＩＭ邐ｉｎ逡逑？Ｋｉｒｉｃ邋ｈｉ＊ｉ逡逑ＰｐｌＢ逡逑Ｐｒｏ＿ｉａｏ？？ｒａＢ0逡逑＾ｉ，Ｕ邐叩０００６０逡逑３ｗ＊ｒｒ？？ｉｌｉｎ邐ｃｕｃｌｅｔｉｈｉＵｎ邋ｓｔ＾ｗｒｆａａｉｌｕ逡逑Ｂ逡逑？■Ｐｒｏｌｉｓｏｍｅｒａｓｅ邋｜逡逑０邋＇１００逡逑圖２－２邋ＡｈＣＹＰ含有的保守蛋白結構域逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｉｎ邋ＡｈＣＹＰ逡逑２．２．１．３邐ＡｈＣＹＰ的理化性質分析逡逑利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ對ＡｈＣＹＰ的一級結構的理化性質進行分析。結果顯示，逡逑ＡｈＣＹＰ的相對分子質量為１８．４邋ｋＤａ，邋ｐｉ為７．７０，其理論半衰期為３０邋ｈ。因其不逡逑穩(wěn)定性指數為１８．７５

ＡＡＧＧＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＯＡＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＩＧＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧ大逡逑ＣＴＧＣＧＯＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＡＧ逡逑圖２－１邋ＯＲＦｆｍｄｅｒ的分析結果逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ逡逑２．２．１．２邐ＡｈＣＹＰ的結構域分析逡逑通過ＮＣＢＩ在線網站中的Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ對ＡｈＣＹＰ蛋白質保守結構域逡逑進行分析。結果發(fā)現，ＡｈＣＹＰ屬于親環(huán)素超家族（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ邋ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ），具逡逑有肽基脯氨酸順反異構酶活性（ＰｐｉＢ），其結構域共有１５２個氨基酸組成。ＡｈＣＹＰ逡逑也是親環(huán)素型肽基脯氨酸順反式異構酶（Ｐｍ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），其結構域共有１６４個逡逑氨基酸組成（圖２－２Ａ）。ＳＭＡＲＴ分析結果顯示，，ＡｈＣＹＰ具有Ｐｒｏ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，逡逑與邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋Ｄｏｍａｉｎｓ邋分析結果一致（圖邋２－２Ｂ）。逡逑Ａ逡逑９邐Ｕ邐？邐ＩＭ邐Ｕｌ邐ＩＭ邐ｉｎ逡逑？Ｋｉｒｉｃ邋ｈｉ＊ｉ逡逑ＰｐｌＢ逡逑Ｐｒｏ＿ｉａｏ？？ｒａＢ0逡逑＾ｉ，Ｕ邐叩０００６０逡逑３ｗ＊ｒｒ？？ｉｌｉｎ邐ｃｕｃｌｅｔｉｈｉＵｎ邋ｓｔ＾ｗｒｆａａｉｌｕ逡逑Ｂ逡逑？■Ｐｒｏｌｉｓｏｍｅｒａｓｅ邋｜逡逑０邋＇１００逡逑圖２－２邋ＡｈＣＹＰ含有的保守蛋白結構域逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｉｎ邋ＡｈＣＹＰ逡逑２．２．１．３邐ＡｈＣＹＰ的理化性質分析逡逑利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ對ＡｈＣＹＰ的一級結構的理化性質進行分析。結果顯示，逡逑ＡｈＣＹＰ的相對分子質量為１８．４邋ｋＤａ
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.2

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本文編號：2678700