【摘要】：金鐵鎖Psammosilene tunicoides是石竹科金鐵鎖屬的單種屬植物,為國家二級保護(hù)植物,是“云南白藥”的主要組成藥材之一,其主要成分為齊墩果烷型的五環(huán)三萜皂苷。由于金鐵鎖三萜皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜,人工合成困難,且其天然資源來源受限,急需尋找合成該資源的新途徑。通過對金鐵鎖三萜皂苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的調(diào)控研究,利用基因工程技術(shù)對金鐵鎖三萜皂苷進(jìn)行體外合成,是獲得大量金鐵鎖三萜皂苷的新途徑。本研究采用酵母雙雜的方法驗證轉(zhuǎn)錄因子MYC2與金鐵鎖三萜皂苷合成途徑上3個關(guān)鍵酶的相互關(guān)系。采用TA克隆、直接構(gòu)建融合表達(dá)載體及無縫克隆的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒;采用實時熒光定量PCR的方法檢測Ptβ-AS、PtSE1、PtSE2、PtMYC2基因在經(jīng)茉莉酸甲酯處理后0h、2h、12h、24h后基因表達(dá)量的變化�；谡n題組前期獲得的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,從大量轉(zhuǎn)錄本中篩選出被注釋為β-AS、SE1、SE2和MYC2的基因,針對酵母雙雜誘餌蛋白的構(gòu)建要求,對轉(zhuǎn)錄本及所獲得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,同時根據(jù)轉(zhuǎn)錄本序列,設(shè)計各基因的全長擴(kuò)增引物。采用TA克隆的方法,獲得了pGADT7-Ptβ-AS和pGADT7-PtSE1兩個獵物融合表達(dá)載體。Ptβ-AS全長為2715bp,具有完整的ORF,2283bp,預(yù)測為非跨膜蛋白、非分泌蛋白,不適合構(gòu)建誘餌蛋白;PtSE1基因全長為1855bp,具有完整ORF,1467bp,為非跨膜蛋白,非分泌蛋白,可用于構(gòu)建誘餌蛋白。采用直接構(gòu)建融合表達(dá)載體的方法,獲得了pGBKT7-PtSE1和pGBKT7-PtSE2兩個誘餌融合表達(dá)載體,以及pGADT7-PtSE2一個獵物融合表達(dá)載體。PtSE2全長1931bp,具有完整ORF,1566bp,為非分泌蛋白,但為跨膜蛋白,故不符合構(gòu)建誘餌蛋白的要求。采用無縫克隆的方法獲得了pGBKT7-PtMYC2和pGADT7-PtMYC2兩個融合表達(dá)載體,PtMYC2為首次從金鐵鎖中克隆得到,克隆所得的PtMYC2基因全長為1932bp,具有完整ORF1716bp,編碼571個氨基酸,為非跨膜蛋白,非分泌蛋白,可用于構(gòu)建誘餌蛋白。采用實時熒光定量PCR的方法檢測MYC2、SE1、SE2、β-AS基因在經(jīng)茉莉酸甲酯處理后的基因表達(dá)量變化,用MeJA處理2h以后,各基因的相對表達(dá)量均較空白組下降;12h后β-AS、SE1與SE2均有不同程度的表達(dá)量回升,只有MYC2還在下降;24h后,四個基因的相對表達(dá)量均有不同程度的上升,表明MeJA的處理時間對基因的相對表達(dá)量有一定影響。經(jīng)過酵母雙雜實驗驗證,PtSE1蛋白與PtMYC2蛋白可能不存在互作的關(guān)系。
【圖文】：

服務(wù)器分析蛋白的結(jié)構(gòu)域功能。使WISS-MODEL 同源模建蛋白質(zhì)的第三節(jié) 實驗結(jié)果 GAD-Ptβ-AS、GAD-PtSE取苗為材料，利用 RNA 提取試劑盒檢測如圖 1-1 所示，，提取的總 R8S RNA 和 18S RNA。經(jīng)超微量紫值為 2 左右，說明所獲得的 RNA究。

圖 1-2 PCR 擴(kuò)增得到的 Ptβ-AS、PtSE1：Marker DL2000；1~4：Ptβ-AS；8~10：PtSE1；5、11：陰性對粒條帶進(jìn)行膠回收后，將回收產(chǎn)物與 pMD18-T 載體 16℃液 PCR 檢測得到的陽性克隆菌送測序，將測序正確的陽圖 1-3）。圖 1-3 pMD18-T-Ptβ-AS 和 pMD18-T-PtSE1 重組質(zhì)粒er DL2000；1~12：pMD18-T- Ptβ-AS；13~24：pMD18-T-PtSE1
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239;Q943.2

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本文編號：2672117