【摘要】：棉花是我國重要的經(jīng)濟作物,在國民經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮重要作用。由于近年來環(huán)境條件日益惡化、耕地減少、水資源日漸匱乏,利用基因工程手段培育產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病蟲的轉(zhuǎn)基因棉花品種將成為全世界關(guān)注的熱點問題。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根具有生長迅速、誘導(dǎo)周期短、無需添加激素、次生代謝產(chǎn)物含量高等特點,本試驗對發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)棉花毛狀根的部分影響因素進行優(yōu)化,為棉花毛狀根的后續(xù)抗逆研究及棉花毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)提供參考。試驗主要結(jié)果如下:1.中24在K599的誘導(dǎo)下,三種不同的外植體中以帶子葉節(jié)的下胚軸誘導(dǎo)效率最高,可以達到68%以上,更適合作為轉(zhuǎn)化外植體,子葉次之,下胚軸誘導(dǎo)生根能力較差。2.在侵染時間的研究中發(fā)現(xiàn),在侵染10min時,K599誘導(dǎo)外植體生根的效率最高。在侵染后共培養(yǎng)時間的優(yōu)化試驗中發(fā)現(xiàn)在28℃黑暗培養(yǎng),共培養(yǎng)2d,帶子葉節(jié)的下胚軸毛狀根誘導(dǎo)率可高達66.8%,成功建立了棉花毛狀根誘導(dǎo)體系,優(yōu)化提高了K599對棉花品種中棉所24毛狀根的轉(zhuǎn)化效率。3.進一步對中棉所24的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進行激素誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)中24以帶子葉節(jié)下胚軸為外植體時,NAA(0.1mg/L)和2,4-D(0.1mg/L)激素組合對中24的愈傷組織誘導(dǎo)率較高,其愈傷組織的形態(tài)為白色或綠色的緊致組織,并能繼續(xù)誘導(dǎo)出大量毛狀根。IAA(0.1mg/L)和6BA(1.0mg/L)激素組合條件下棉花愈傷組織長勢快,但是不能誘導(dǎo)出毛狀根。4.PCR檢測和GΜS染色表明轉(zhuǎn)基因毛狀根擴增有目的條帶,染色顯著變藍,為陽性毛狀根。綜合以上結(jié)果,本試驗建立并優(yōu)化了發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系,成功獲得陽性轉(zhuǎn)基因毛狀根,為棉花轉(zhuǎn)基因研究的提升和改進提供方法和奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2-1 質(zhì)粒檢測膠圖Fig. 2-1 Plasmid detection glμe map.養(yǎng)及其培養(yǎng)條件所 24 作為供試棉花品種。在將種子用飽滿棉種，將其置于 250 mL 的錐形瓶%雙氧水，將加雙氧水的錐形瓶放在 2雙氧水，再用無菌水沖洗 3~4 次，最后續(xù)在 28℃搖床上，黑暗條件下振蕩至水沖洗 2 次，每次 1 min，，然后倒掉無璃培養(yǎng)皿中，用手擠掉種殼，將去掉中，每管 3 粒。將這些種植有棉花種子養(yǎng)，光照為 2000 Lx，光周期為 16 h 光照葉、莖稈上有無菌絲，然后選擇無菌幼用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化。

圖 3-1 子葉誘導(dǎo)的毛狀根圖 3-2 帶子葉節(jié)的下胚軸誘導(dǎo)的毛狀根圖 3-3 繼代培養(yǎng)的毛狀根分支Fig. 3-1 Hairy roots indμced by cotyledon. Fig. 3-2Hypocotyl - indμced hairy roots of cotyledons. Fig. 3-3hairy root branchesof the secondary cμltμre.表 3-1 棉花不同外植體的毛狀根誘導(dǎo)率Table 3-1 The indμction rates of hairy roots from different explants in cotton誘導(dǎo)率/%外植體對照 子葉 對照 莖段 對照帶子葉節(jié)下軸第一組 0 33 0 6 0 60第二組 0 36 0 5 0 51第三組 0 35 0 3 0 483. 3 不同侵染方法對棉花毛狀根誘導(dǎo)的比較本試驗在發(fā)根農(nóng)桿菌 K599 的誘導(dǎo)試驗中，分別采取靜止浸泡和搖床中振蕩兩侵染方法對棉花外植體進行侵染處理,發(fā)現(xiàn)靜止浸泡侵染誘導(dǎo)率最高，帶子葉節(jié)下軸發(fā)根率達 66%；而溫度 28℃轉(zhuǎn)速為 250 r/min 搖床振蕩的侵染方法不適合棉花轉(zhuǎn)
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S562

【參考文獻】

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本文編號：2670983