【摘要】：黃花苜蓿(Medicago falcata L.)和紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是重要的豆科牧草,具有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富、粗蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn),是優(yōu)質(zhì)飼用植物。黃花苜�？鼓嫘詮�(qiáng),具有耐旱、耐寒、耐鹽堿的優(yōu)良品質(zhì),紫花苜蓿產(chǎn)草量高、適應(yīng)性強(qiáng),因此它們是天然的基因資源庫。鈣調(diào)素類蛋白(Calmodulin-like protein,CML)是重要的Ca~(2+)結(jié)合蛋白,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用,然而黃花苜蓿及紫花苜蓿中有關(guān)鈣調(diào)素類蛋白的研究還鮮有報(bào)道。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘黃花和紫花苜蓿中鈣調(diào)素類蛋白基因,對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)12個(gè)特有的預(yù)測(cè)編碼鈣調(diào)素類蛋白基因,運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥Col-0基因組中,獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥。本研究對(duì)黃花苜蓿的兩個(gè)基因MfCML29和MfCML1在植物生長(zhǎng)過程中的生理功能進(jìn)行探討,為苜蓿中鈣調(diào)素類蛋白的相關(guān)研究提供參考。本論文主要結(jié)果如下:⑴通過Gateway克隆技術(shù)連接12個(gè)基因到雙元表達(dá)載體pGWB605和pGWB617上,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,在含草銨膦的抗性培養(yǎng)基上篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)12個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因株系。⑵對(duì)12個(gè)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,其中MfCML29和MfCML1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明均含有一個(gè)EF-hand保守結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,MfCML29和MfCML1蛋白均定位在植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。⑶對(duì)MfCML29和MfCML1轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同礦質(zhì)陽離子培養(yǎng)基上進(jìn)行表型分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥在含不同Ca~(2+)、Zn~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)濃度的培養(yǎng)基上,幼苗生長(zhǎng)表型與野生型擬南芥Col-0相比,均無顯著差異,但在不同F(xiàn)e~(2+)濃度培養(yǎng)基上存在區(qū)別,在低鐵條件下,MfCML29和MfCML1轉(zhuǎn)基因擬南芥具有抗低鐵表型,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片大且顏色比Col-0綠,根長(zhǎng)、鮮重顯著高于Col-0,由此推測(cè)黃花苜蓿鈣調(diào)素類蛋白候選基因MfCML29和MfCML1參與調(diào)控植物Fe營(yíng)養(yǎng)平衡。⑷為了進(jìn)一步探討MfCML29轉(zhuǎn)基因擬南芥低鐵敏感表型的機(jī)制,測(cè)量轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0全苗Fe元素含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)的鐵含量顯著高于Col-0,說明MfCML29參與Fe元素的積累。
【圖文】：

育中發(fā)揮著重要的作用[37-39]。Ca2+參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)多種外部和內(nèi)干旱、鹽分、病原體、光線、激素信號(hào)[40,41]，植物受到外界刺激內(nèi)的鈣離子濃度會(huì)發(fā)生變化，對(duì)刺激做出相應(yīng)的生理反應(yīng)。而有應(yīng)，目前存在兩種不同的假說，分別為鈣簽假說和鈣轉(zhuǎn)換器假說[器假說，該假說觀點(diǎn)是，下游產(chǎn)生的特異性反應(yīng)與鈣離子結(jié)合蛋轉(zhuǎn)換器主要被分為三類：第一類為鈣調(diào)蛋白（CaM）和類鈣調(diào)素鈣調(diào)素 B 類蛋白（CBL），最后一類是鈣依賴型蛋白激酶（CDPK具有至少一個(gè)保守的 Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域 EF-hand ，EF-hand 由 29 個(gè) 12 個(gè)氨基酸組成轉(zhuǎn)杯結(jié)構(gòu)的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，中間的轉(zhuǎn)杯結(jié)構(gòu)EF-hand 結(jié)構(gòu)域含有 Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，與 Ca2+結(jié)合后構(gòu)象會(huì)發(fā)生變目標(biāo)進(jìn)行一系列反應(yīng)[51]，擬南芥中就有 250 個(gè)蛋白含有 EF 手單元感器，在無數(shù)細(xì)胞現(xiàn)象中的作用已得到很好的證明[53,54]，有關(guān)于 C的研究也很多，特別是擬南芥中的 CMLS。

不同物種 CMLs 表達(dá)模式是多種多樣的，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中都發(fā)揮著重要的作用[59,67]。目前為止分析的比較透徹的幾種 CML 蛋白受到不同的生物/非生物刺激或激素脅迫時(shí)會(huì)表不同的功能。AtCML8 在經(jīng)過水楊酸或 NaCl 處理的植物中進(jìn)行表達(dá)[68]。AtCML9 的表達(dá)是非生物脅迫和脫落酸誘導(dǎo)的，突變體分析表明，AtCML9 通過對(duì) ABA 介導(dǎo)的通路，在鹽脅耐受中發(fā)揮作用[69]。AtCML19 的表達(dá)在 DNA 受到 uv 損傷時(shí)上調(diào)，并且推測(cè)參與了受損NA 的修復(fù)[70,71]。AtCML24 對(duì)擬南芥葉片 NO 的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用，敲除植株表現(xiàn)出的癥與 NO 產(chǎn)生的病原體的缺乏和過敏反應(yīng)相同[72]。在植物中，AtCML43 的過表達(dá)加速了超敏應(yīng)，表明其在植物對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)中起作用[73]。CML 蛋白也與植物發(fā)育有關(guān)，tCML37、AtCML38 和 AtCML39 在不同發(fā)育時(shí)期的刺激下表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化[74]，，而其它MLs 影響發(fā)育調(diào)控。AtCML20 據(jù)稱具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的功能[75]，而 AtCML42 的敲除植株顯示出毛狀體形態(tài)的變化[76]。然而，對(duì)于大多數(shù) CMLs 來說，它們的亞細(xì)胞定位和具體功圖 1.2 CMLs 在植物細(xì)胞中的功能模式[65,66]Fig.1.2 Functional patterns of CMLs in plant cells
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S541

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本文編號(hào)：2670906