發(fā)布時(shí)間：2020-05-15 05:20

【摘要】：蒲公英(Taraxacum F.H.Wigg)廣泛分布于世界各地,是菊科植物舌狀花亞科最進(jìn)化類群之一。綠原酸是蒲公英主要生物活性成分之一,具有抗氧化、消炎、抗菌、抗病毒等作用。蒲公英中綠原酸生物合成機(jī)制尚未見報(bào)道,綠原酸生物合成途徑的研究可以為提高其藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。本論文以東北地區(qū)丹東蒲公英(Taraxacum antungense Kitag.)為研究材料,以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)種質(zhì)資源異位保存圃為研究地點(diǎn),克隆獲得綠原酸生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶基因TaHQT1和TaHQT2,遺傳轉(zhuǎn)化獲得TaHQT1過表達(dá)株系和RNAi株系后進(jìn)行分析并評價(jià)株系的穩(wěn)定性,評價(jià)植物的抗氧化能力。原核表達(dá)獲得TaHQT1/2蛋白,測定蛋白酶活動(dòng)力學(xué)參數(shù)并比較蛋白酶對綠原酸合成的影響。克隆獲得TaHQT2基因啟動(dòng)子并分析其順式作用元件,為研究綠原酸生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。克隆獲得TaMYC1轉(zhuǎn)錄因子,酵母單雜交確定TaMYC1能與TaHQT2啟動(dòng)子結(jié)合,酵母雙雜交篩選獲得TaMYB59轉(zhuǎn)錄因子,為明確轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控綠原酸生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.同源克隆獲得了TaHQT1和TaHQT2基因,構(gòu)建了pCAMBIA1300-35S-X-TaHQTs RNAi載體并獲得其轉(zhuǎn)基因株系。TaHQT1和TaHQT2 RNAi愈傷組織中綠原酸含量下降了39.74%和47.09%。因此,TaHQT2基因?qū)G原酸生物合成影響效果更好。TaHQT2構(gòu)建pRI101-AN過表達(dá)載體并獲得轉(zhuǎn)基因株系,分析發(fā)現(xiàn)綠原酸含量與對照組相比增加了82.49%,咖啡酸含量差異不顯著。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)TaHQT1和TaHQT2基因在根和葉中的表達(dá)量與綠原酸含量成正相關(guān),上述結(jié)果表明TaHQT1和TaHQT2正調(diào)控綠原酸的生物合成。2.對TaHQT2轉(zhuǎn)基因丹東蒲公英進(jìn)行鹽脅迫處理,測定各處理MDA酶活性,脯氨酸和總?cè)~綠素含量。200 mM NaCl處理前后,過表達(dá)株系MDA含量增加了96%,對照組(296.6%)和RNAi干擾組(310.6%);過表達(dá)株系谷氨酸(proline)含量增加了51.5%,對照組(403.6%)和RNAi干擾組(562.7%);TaHQT2過表達(dá)株系綠原酸含量高于對照組和RNAi干擾組。結(jié)果顯示TaHQT2過表達(dá)株系的鹽脅迫能力高于對照組和RNAi株系。3.亞細(xì)胞定位確定TaHQT1定位于細(xì)胞核,TaHQT2定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-TaHQT1/2后,經(jīng)過原核表達(dá)純化和western blot確定了純化的融合蛋白分子量大小為65Kd,酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定TaHQT1和TaHQT2均能夠在體外催化咖啡酰輔酶a與奎尼酸形成綠原酸。4.克隆獲得TaHQT2基因的啟動(dòng)子,分析確定proTaHQT2含有4個(gè)E-box,且可能受到MeJA調(diào)控;克隆獲得TaMYC1轉(zhuǎn)錄因子,MeJA誘導(dǎo)下TaMYC1和TaHQT1/2基因表達(dá)量均顯著增加。按照上述方法確定TaMYC1可促進(jìn)綠原酸的生物合成。qRT-PCR確定TaMYC1提高苯丙氨酸合成途徑的TaC4H、Ta4CL和TaHQT2基因的表達(dá)量。酵母單雜交確定TaMYC1能夠通過結(jié)合proTaHQT2從而調(diào)控綠原酸的生物合成。5.構(gòu)建丹東蒲公英酵母cDNA文庫,并進(jìn)行文庫質(zhì)量評價(jià)。構(gòu)建了BD-TaMYC1誘餌載體并進(jìn)行篩庫,篩選出一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子并命名為TaMYB59。點(diǎn)對點(diǎn)雙雜交確定TaMYC1能與TaMYB59進(jìn)行互作。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述Li et al., 2018; Liu et al., 2017）。4-香豆酰-CoA-連接酶（4-coumaroyl-CoA催化對香豆素從而形成對香豆素輔酶 a 進(jìn)行下游支路，同時(shí)也是催化苯丙后一個(gè)修飾酶，由多種同工酶共同催化，，并且受到外界環(huán)境因子的作用。已病原菌的作用下可以受到生物脅迫從而誘導(dǎo)類黃酮的合成（Khakdan et al4H 和 4CL 是苯丙氨酸合成途徑的關(guān)鍵限速酶，同時(shí)為下游苯丙氨酸代謝代謝途徑提供作用底物（Yuan et al., 2014）。如查爾酮合成酶（Chalcone s催化對香豆素輔酶 a 向黃酮類和類黃酮類化合物的進(jìn)行，而 HCT/F3H 催輔酶 a 向綠原酸和咖啡酸生物合成途徑進(jìn)行。

技術(shù)路線
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239

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本文編號：2664533