【摘要】：類泛素小蛋白修飾物(Small Ubiquitin-related Modifier,SUMO)是一種在結(jié)構(gòu)上與泛素類似的小分子蛋白,主要通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程。SUMO化修飾是一種可逆的級(jí)聯(lián)反應(yīng),SUMO前體蛋白通過(guò)SUMO蛋白酶的水解,暴露出雙甘氨酸結(jié)構(gòu),形成具有功能的成熟SUMO蛋白,經(jīng)過(guò)E1活化酶、E2結(jié)合酶和E3連接酶的作用,能夠可逆的將SUMO分子結(jié)合到特異的底物蛋白上,從而改變底物的定位、穩(wěn)定性和活性等,參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。在模式生物擬南芥中,SUMO分子在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、環(huán)境脅迫應(yīng)答與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面都起著重要的作用;研究室前期研究中已知高溫、高鹽、ABA等脅迫下大豆蛋白快速發(fā)生SUMO化以響應(yīng)非生物脅迫,但在大豆中,SUMO分子在植物非生物脅迫應(yīng)答中的具體功能仍未見報(bào)道。因此本研究擬通過(guò)GmSUMO2基因功能的初步研究,從蛋白翻譯后修飾的角度補(bǔ)充完善植物非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并為大豆抗逆分子育種提供植物材料,具有重要的理論研究意義和育種應(yīng)用價(jià)值。本研究首先克隆GmSUMO2基因并進(jìn)行序列分析,為了便于后續(xù)研究中對(duì)大豆SUMO化底物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,將GmSUMO2分子第94位氨基酸由組氨酸(H)突變?yōu)榫彼?R),增加一個(gè)胰蛋白酶識(shí)別的精氨酸位點(diǎn),水解后可獲得便于質(zhì)譜分析的C端多肽標(biāo)簽,同時(shí)可將SUMO化底物與泛素化底物區(qū)分開�？寺～@得GmSUMO2和GmSUMO2(H94R)后,構(gòu)建植物表達(dá)載體pTF101-6×His-GmSUMO2和pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R),通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)大豆毛狀根,獲得GmSUMO2和GmSUMO2(H94R)超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根,對(duì)其進(jìn)行ABA及干旱脅迫處理,對(duì)比在非生物脅迫下的表型差異,分析GmSUMO2基因在大豆非生物脅迫響應(yīng)中的功能;另外,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)GmSUMO2基因的大豆PCR陽(yáng)性植株,為后續(xù)深入研究大豆SUMO分子的功能提供了研究材料。本研究取得的主要研究結(jié)果如下:(1)克隆了GmSUMO2基因,通過(guò)對(duì)大豆GmSUMOs基因序列的同源性比較,發(fā)現(xiàn)GmSUMO2與擬南芥AtSUMO1相似性極高;對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)GmSUMO2基因在大豆不同的組織中均有表達(dá);通過(guò)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)GmSUMO2基因中存在多種非生物脅迫響應(yīng)元件;利用qRT-PCR對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析證實(shí)GmSUMO2在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)鹽、熱、ABA及干旱均有響應(yīng)。(2)在GmSUMO2基因5’端融合6×His標(biāo)簽序列,并將表達(dá)產(chǎn)物C端暴露雙甘氨酸結(jié)構(gòu),同時(shí)利用特異性引物PCR擴(kuò)增的方法,獲得第94位氨基酸由H突變?yōu)镽的點(diǎn)突變形式GmSUMO2(H94R);分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體pTF101-6×His-GmSUMO2和pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R)并轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌;利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生毛狀根,通過(guò)PCR檢測(cè)和Western blot檢測(cè),證實(shí)GmSUMO2基因在轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中表達(dá),分別獲得了轉(zhuǎn)pTF101-6×His-GmSUMO2和轉(zhuǎn)pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R)的大豆陽(yáng)性毛狀根;(3)利用0μΜ、15μΜ、25μΜ的ABA和100 mM甘露醇對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根進(jìn)行脅迫處理,(以空菌誘導(dǎo)的毛狀根作為對(duì)照)。表型分析顯示GmSUMO2和GmSUMO2(H94R)超表達(dá)毛狀根對(duì)ABA的敏感性增強(qiáng);經(jīng)qRT-PCR檢測(cè),證實(shí)GmSUMO2在轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中表達(dá)顯著上調(diào),在ABA處理下GmSUMO2基因上調(diào)表達(dá)幅度比對(duì)照毛狀根更大;同時(shí)檢測(cè)了參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的轉(zhuǎn)錄因子ABI3/5、SnRK1.1/1.2的相對(duì)表達(dá)量變化,發(fā)現(xiàn)ABI3/5在脅迫處理前后具有相似的表達(dá)趨勢(shì),在ABA處理下對(duì)照毛狀根中上調(diào)表達(dá)極顯著,而在轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中在15μΜABA處理下相對(duì)表達(dá)量變化不顯著,且顯著低于對(duì)照毛狀根中的相對(duì)表達(dá)量;當(dāng)ABA濃度達(dá)到25μΜ時(shí),轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中ABI3/5的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào);而SnRK1.1/SnRK1.2在對(duì)照毛狀根中在ABA處理前后相對(duì)表達(dá)量變化不顯著,在轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中相對(duì)表達(dá)量隨著ABA濃度的增加而升高;在干旱脅迫處理下,轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根的生長(zhǎng)受到抑制,qRT-PCR分析表明干旱脅迫相關(guān)基因DREB2A在轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根中顯著上調(diào)表達(dá),而另一個(gè)相關(guān)基因bZIP1相對(duì)表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因大豆毛狀根和對(duì)照毛狀根中在脅迫處理前后并無(wú)顯著差異。此外,結(jié)果表明GmSUMO2(H94R)轉(zhuǎn)基因材料和GmSUMO2轉(zhuǎn)基因材料在脅迫處理前后大豆毛狀根的表型和基因表達(dá)水平方面均無(wú)顯著區(qū)別,證明H94R點(diǎn)突變對(duì)GmSUMO2基因功能無(wú)影響。(4)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法對(duì)大豆品種“東農(nóng)50”子葉節(jié)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,分別獲得轉(zhuǎn)pTF101-6×His-GmSUMO2的PCR陽(yáng)性植株2株和轉(zhuǎn)pTF101-6×His-GmSUMO2(H94R)的PCR陽(yáng)性植株2株,目前已收獲T_1代種子14粒,為后續(xù)深入研究大豆SUMO分子的功能提供了前期材料。
【圖文】：

利用免疫共沉淀技術(shù)已鑒定出受體蛋白的賴氨酸確實(shí)是物蛋白的 SUMO 化作用，使底物蛋白的穩(wěn)定性及蛋白構(gòu)象發(fā)生了細(xì)胞內(nèi)的重新定位、功能、穩(wěn)定性和活性等多個(gè)方面[8]。為真核生物研究的模型，在 SUMO 研究進(jìn)程中起到了重要的作用統(tǒng)來(lái)研究底物蛋白 SUMO 化功能，可以在不同的發(fā)育水平上進(jìn)行可以通過(guò)涉及 SUMO 化途徑中其他成員的突變體，確定靶蛋白由中實(shí)現(xiàn)了植物表型與相關(guān)靶蛋白的 SUMO 化狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)的[4,6]。在酵母和哺乳動(dòng)物中 SUMO 化修飾相關(guān)研究較為早期對(duì)滯后，且研究結(jié)果主要集中在模式植物擬南芥和水稻中，當(dāng)植物時(shí) SUMO1/2 結(jié)合物水平變化幅度非常大，其中熱激 2 分鐘內(nèi)檢測(cè)生變化證明了其在植物對(duì)熱脅迫的早期反應(yīng)，超表達(dá) SUMO2 結(jié)合物的積累，表明 SUMO 化是植物脅迫響應(yīng)的重要特征，，有研37℃中熱處理 30 分鐘，24℃恢復(fù)培養(yǎng)，會(huì)迅速的累積 SUMO 結(jié)合，結(jié)合物水平在 0.5 h-1 h 之間達(dá)到最高，4 h 后恢復(fù)到正常水平，雙突變背景下表達(dá)時(shí)，結(jié)合物水平極低，說(shuō)明熱激會(huì)誘導(dǎo) SUMO1并且由熱激誘導(dǎo)的 SUMO 結(jié)合物積累在細(xì)胞核中[7]。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文根，經(jīng) PCR、qRT-PCR 檢測(cè)以及 Western blot 檢測(cè)，分別獲得轉(zhuǎn) pTF101-6×His-GmSUMO2 和轉(zhuǎn) pTF101-6×His-GmSUMO2（H94R）的陽(yáng)性毛狀根；植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105并介導(dǎo)對(duì)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化，分別獲得轉(zhuǎn) pTF101-6×His-GmSUMO2 和轉(zhuǎn) pTF101-6×His-GmSUMO2（H94R）的 PCR 陽(yáng)性植株；獲得 PCR 陽(yáng)性的 T0代轉(zhuǎn)基因大豆株系；（4）抗逆性分析：對(duì)轉(zhuǎn) pTF101-6×His-GmSUMO2 和轉(zhuǎn) pTF101-6×His-GmSUMO2（H94R）的陽(yáng)性毛狀根進(jìn)行 0 μΜ，15 μΜ，25 μΜ 的 ABA 和 100 mM 甘露醇的非生物脅迫（以 K599空菌誘導(dǎo)的毛狀根作為對(duì)照），對(duì)比分析表型；通過(guò) qRT-PCR 分析脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量變化，分析其在非生物脅迫下的功能。1.3.2 技術(shù)路線
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S565.1

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本文編號(hào)：2656671