發(fā)布時間：2020-05-07 08:20

【摘要】：氮是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素。豆科植物能與根瘤菌共生形成固氮器官—根瘤,從而固定空氣中的氮?dú)鉃橹参锾峁┛衫玫牡�。共生固氮是多基因控制的�?shù)量性狀,其過程主要包括根瘤菌的侵染、根瘤原基的形成以及固氮根瘤的發(fā)育,這些過程均受到微生物與宿主的嚴(yán)格調(diào)控,然而其具體的遺傳分子機(jī)制仍不十分清楚。根瘤原基的膨大發(fā)育對形成根瘤和高效固氮至關(guān)重要,但國內(nèi)外在調(diào)控根瘤發(fā)育方面的研究進(jìn)展較為緩慢,其主要遺傳分子調(diào)控機(jī)制尚未被闡明。本研究利用正向遺傳學(xué)手段定位到大豆(Glycine max)中控制根瘤大小的重要QTL(Quantitative trait locus)位點(diǎn),克隆了候選基因INCREASING NODULE SIZE1(GmINS1),并對其進(jìn)行了功能分析,主要研究結(jié)果如下:(1)本研究利用已建立遺傳圖譜的P1×P2大豆重組自交系(Recombinant inbred lines,RILs)群體為材料,對大豆結(jié)瘤相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位分析,發(fā)現(xiàn)了1個控制根瘤大小的QTL位點(diǎn):qBNF-11,通過候選基因預(yù)測及篩選,獲得并克隆了qBNF-11中控制根瘤大小的主效基因INCREASING NODULE SIZE1(GmINS1)。(2)生物信息學(xué)分析表明:GmINS1屬于大豆β-擴(kuò)張蛋白家族,編碼細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白,該家族在大豆中共有9個成員。GmINS1與實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控大豆結(jié)瘤的擴(kuò)張蛋白GmEXPB2屬于同一擴(kuò)張蛋白家族,兩者之間表現(xiàn)出78%的氨基酸序列相似性。(3)定性PCR檢測發(fā)現(xiàn)P1和P2兩個親本在GmINS1啟動子區(qū)域中存在4個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)�；贕US酶活性和啟動子區(qū)段分析發(fā)現(xiàn),親本P2基因型中包含的SNP A/C對GmINS1表達(dá)具有顯著影響。在親本、40個來自親本的RILs和40個選自大豆核心種質(zhì)資源庫的材料中,包含SNP C的P2基因型的GmINS1啟動子能顯著增強(qiáng)GmINS1的轉(zhuǎn)錄水平并促進(jìn)根瘤發(fā)育。說明GmINS1的表達(dá)與根瘤發(fā)育顯著相關(guān)。(4)組織化學(xué)定位結(jié)果表明:GmINS1基因在根瘤快速發(fā)育階段高度表達(dá)。GmINS1啟動子驅(qū)動GUS的染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因主要在根瘤組織的維管束、皮層和薄壁細(xì)胞中表達(dá)。說明GmINS1可能主要參與調(diào)控根瘤膨大發(fā)育過程。(5)GmINS1在根瘤發(fā)育過程中的生物學(xué)功能研究結(jié)果表明:GmINS1的過量表達(dá)能顯著增加大根瘤的數(shù)目、重量和侵染細(xì)胞的數(shù)目、大小,并提高根瘤的固氮酶活性,進(jìn)而改變了大豆植株的生物量和氮含量。而RNA干涉抑制GmINS1的表達(dá)則會顯著抑制根瘤的發(fā)育,導(dǎo)致大根瘤數(shù)目、重量和侵染細(xì)胞數(shù)目、大小都顯著減少并且根瘤固氮酶活性顯著降低。(6)擴(kuò)張蛋白在豆科植物的結(jié)瘤過程中發(fā)揮重要作用,對于依靠細(xì)胞擴(kuò)張膨大來完成發(fā)育的有限型根瘤來說更是必不可少。生物學(xué)功能研究結(jié)果表明:雙重干涉GmINS1和GmEXPB2顯著抑制大豆結(jié)瘤過程,其中大根瘤數(shù)目、重量,單個根瘤大小,根瘤內(nèi)侵染細(xì)胞的發(fā)育和根瘤固氮酶活性都受到顯著抑制。綜上所述,本研究通過圖位克隆獲得了控制根瘤大小的候選基因GmINS1。發(fā)現(xiàn)GmISN1編碼細(xì)胞壁β-擴(kuò)張蛋白,是調(diào)控根瘤發(fā)育的關(guān)鍵基因;GmINS1和GmEXPB2能協(xié)同調(diào)控大豆的結(jié)瘤過程。研究結(jié)果為通過分子育種途徑,培育高效固氮的大豆新品系提供了理論依據(jù)和候選基因。
【圖文】：

圖 1-1 豆科植物無限型和有限型根瘤示意圖[38]Fig. 1-1 Diagram of the indeterminate and determinate nodules in legumes[38]注：A，無限型根瘤。I：頂端分生區(qū)；II：侵染區(qū)；II-III：過渡區(qū)；III：固氮區(qū)；IV：衰老區(qū)。B，有限型根瘤。Note: A, Indeterminate nodule. I, Meristem zone. II, Infection zone. II-III, Interzone. III, Fixation zone.IV, Senecense zone. B, Determinate nodule.1.2.2 根瘤形成與發(fā)育的分子機(jī)制關(guān)于豆科植物的結(jié)瘤固氮機(jī)制，國內(nèi)外對根瘤菌侵染的信號識別感知、早期共生信號傳導(dǎo)途徑、侵染線形成和結(jié)瘤固氮的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及分子調(diào)控機(jī)理的分子基礎(chǔ)均有大量報(bào)道[35, 42-44]。結(jié)瘤早期信號傳導(dǎo)途徑中相關(guān)調(diào)控基因的分離主要通過對百脈根、苜蓿、豌豆和三葉草等豆科模式植物的突變株的研究逐步獲得[6]。豆科植物的根系通過向根際分泌類黃酮物質(zhì)，把與之共生的根瘤菌吸引到根部并刺激它們產(chǎn)生 Nod 結(jié)瘤因子。研究發(fā)

圖 1-2 早期結(jié)瘤階段信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[59]Fig. 1-2 Signal-transduction pathway associated with the early stages of nodulation[5根瘤原基形成后，進(jìn)一步發(fā)育形成具有高效固氮能力的成熟根瘤。目前，國內(nèi)外學(xué)者對早期結(jié)瘤階段信號途徑中的分子機(jī)制研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，在不同的豆科植物中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與根瘤發(fā)育過程的基因、小肽和非編碼 RNAs[78-84]。研究表明，，一類特殊的蛋白質(zhì)復(fù)合物 SNARE 參與百脈根中根瘤的正常發(fā)育過程，當(dāng)SNARE 蛋白缺陷時，盡管根瘤能正常形成，但與野生型相比，這些根瘤的固氮活性顯著降低[85]。Takanashi 等發(fā)現(xiàn)百脈根中編碼檸檬酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 LjMATE1 基因在根瘤的侵染區(qū)中特異性表達(dá)，干涉該基因的表達(dá)會顯著抑制根瘤的發(fā)育[86]。一些功能蛋白如鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、突觸融合蛋白、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白高檸檬酸合成酶等也被發(fā)現(xiàn)參與了百脈根根瘤發(fā)育過程[87]。紫花苜蓿中的 MsZPT2屬于 Kruppel 類鋅指蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，通過反義 RNA 阻抑 MsZPT2-1 基因表達(dá)后，植
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S565.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2652693