【摘要】：植酸是磷的主要儲存形式,它作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子,是阻礙植物吸收礦物質(zhì)和降低動物飼料磷利用率的最主要因素。植酸酶的研究和開發(fā)可以有效解決這一問題。目前,人們多利用細菌、真菌和植物等表達系統(tǒng)重組并生產(chǎn)植酸酶,并且應(yīng)用廣泛。但仍舊需要更加綠色、優(yōu)質(zhì)和高效的植酸酶表達系統(tǒng)。蛹蟲草作為一種食用藥用真菌,其成分具有調(diào)節(jié)免疫功能以及抗炎等藥用活性,具備生長周期短,安全性好等優(yōu)點,因此被認(rèn)為是重組表達植酸酶的良好受體材料,但目前尚未報道利用蛹蟲草作為表達載體重組植酸酶。本試驗利用蛹蟲草作為表達載體,將含有植酸酶phyA基因真菌表達載體pCB130NG轉(zhuǎn)入到蛹蟲草菌株中,通過測定蛹蟲草重組表達植酸酶的表達量和酶活情況。再獲得產(chǎn)植酸酶蛹蟲草菌株的同時,大量發(fā)酵進行接下來肉雞飼料添加實驗。實驗選擇了1日齡AA肉雞144只,隨機分為6個處理組,每個處理3個重復(fù),每個重復(fù)有8只肉雞。處理組T0為正常日糧組,處理組T1為正常日糧添加野生型蛹蟲草,處理組T2為正常日糧添加市售植酸酶500 U/kg,處理組T3-T5為正常日糧添加產(chǎn)植酸酶蛹蟲草,添加水平分別為250 U/kg、500 U/kg和1000 U/kg。試驗日期為42天,分前期1-21日齡和后期22-42日齡。分別探究了產(chǎn)植酸酶蛹蟲草對肉雞的生長性能、脛骨發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)利用率以及免疫器官指數(shù)的影響,具體研究結(jié)果如下:1.本試驗利用重組質(zhì)粒pCB130NG-phyA轉(zhuǎn)入蛹蟲草原生質(zhì)體中,通過PCR檢測以及Western Blot檢測得到了轉(zhuǎn)phyA基因的蛹蟲草菌株,ELISA測定phyA基因重組蛋白表達量最高約占總可溶蛋白的0.91±0.064‰,利用鉬釩酸銨比色法測定每克產(chǎn)植酸酶蛹蟲草菌株凍干粉中植酸酶酶活為402.2 U。2.在肉雞生長性能方面,在1-21日齡和22-42日齡處理組T2、T4和T5三組可顯著提升肉雞平均體重(P0.05),同時處理組T2、T4和T5三組在平均日增重和平均日采食量方面均有顯著提高(P0.05)。在1-42日齡時,處理組T2、T4和T5三組肉雞的料重比與對照組差異顯著(P0.05)。3.在脛骨指標(biāo)方面,在21日齡和42日齡時處理組T2、T4和T5三組相比于對照組脛骨灰分含量具有明顯提升(P0.05),同樣對脛骨中磷含量水平有明顯提高(P0.05)。在21日齡時,處理組T2、T4和T5三組處理組對肉雞脛骨中鈣含量有明顯提升(P0.05),在42日齡時處理組T5結(jié)果表示明顯提升肉雞脛骨中鈣含量(P0.05)。4.在營養(yǎng)物質(zhì)利用率方面,在21日齡和42日齡時,添加植酸酶處理組T2、T4和T5三組的粗蛋白利用率較比于對照組T0顯著提升(P0.05)。在磷利用率方面,21日齡和42日齡,添加植酸酶的四個處理組T2-T5相比于對照組T0差異顯著(P0.05)。在鈣利用率方面,21日齡下添加植酸酶的四個處理組T2-T5明顯提高肉雞鈣利用率(P0.05),在42日齡下,處理組T2、T4和T5可明顯提高鈣利用率(P0.05)。5.在免疫器官指數(shù)方面,日糧中添加產(chǎn)植酸酶蛹蟲草相比于對照組,肉雞免疫器官指數(shù)有增加趨勢。
【圖文】：

第三章 結(jié)果與分析.1 利用蛹蟲草表達植酸酶1.1 蛹蟲草的遺傳轉(zhuǎn)化取三塊 1 cm 蛹蟲草菌塊接種于 PDA 液體培養(yǎng)基中，利用混合酶液溶解細胞壁獲草原生質(zhì)體；利用 PEG 轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的含有 phyA 基因的 pCB130NG 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛹生質(zhì)體置于 PDA 再生培養(yǎng)基（潮霉素+卡那霉素為 Hyg650 mg/L+Kan300 mg/L）。長出的單一轉(zhuǎn)化子進行鑒定。具體過程如圖 3.1。

圖 3.2 轉(zhuǎn) pCB130NG-phyA 質(zhì)粒蛹蟲草菌株的 PCR 檢測結(jié)果M: DL2000 DNA Marker；+:陽性對照；－:陰性對照；1~14:再生蛹蟲草菌株Fig 3.2 PCR analysis of transgenic pCB130NG-phA Cordyceps militarisM: DL2000 DNA Marker;+: Positive control；－: Negative control;1~14: Cordyceps militaris regrowth PCR determination基因蛹蟲草的 Western Blot 檢測了驗證 phyA 基因在蛹蟲草中的表達情況，以野生型蛹蟲草菌株作為陰性R 檢測為陽性的菌株進行同時進行 Western Blot 檢測，結(jié)果如圖 3.3 所示蛹蟲草菌株在 68 kDa 處有目的條帶，相比于理論計算的蛋白條帶約 64.是糖基化造成的。而野生型蛹蟲草沒有檢測到目的蛋白片段，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入到蛹蟲草中，，蛹蟲草成功表達植酸酶蛋白。用 ELISA 試劑盒測定產(chǎn)植酸酶 phyA 基因蛹蟲草菌株的表達量。phyA 基因量最高約占總可溶蛋白的 0.91 ±0.064 ‰，將鑒定的高表達的轉(zhuǎn)基因蛹蟲實驗。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.3

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7 許y斏

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