【摘要】：粒重和穗粒數(shù)是玉米單穗產(chǎn)量最重要的影響因子,而籽粒和花序的發(fā)育是影響粒重和穗粒數(shù)的關(guān)鍵因素,因此,克隆玉米籽粒及花序發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵QTL/基因,解析其功能及調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和應(yīng)用意義。本研究通過圖位克隆的方法,克隆了一個(gè)影響玉米籽粒發(fā)育的基因,命名為Empty pericarp10(Emp10),并闡明了其影響籽粒發(fā)育的分子機(jī)制;同時(shí)利用大芻草在現(xiàn)代玉米自交系中的導(dǎo)入系,精細(xì)定位了一個(gè)來源于大芻草的影響玉米穗行數(shù)的主效QTL,命名為teosinte ear rank1(ter1),。獲得的主要研究結(jié)果如下:1、emp10突變體表型分析。emp10突變體籽粒胚和胚乳發(fā)育停滯,成熟后籽�？瞻T,胚致死無法發(fā)芽。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),與野生型相比,突變體的胚停滯在原胚體時(shí)期,胚乳中淀粉積累顯著減少,基部轉(zhuǎn)運(yùn)層細(xì)胞的細(xì)胞壁沒有向內(nèi)生長。2、Emp10的定位克隆。遺傳分析發(fā)現(xiàn)emp10籽�？瞻T性狀受單個(gè)隱性核基因控制,利用B73與emp10突變體雜交構(gòu)建的6912個(gè)F_2個(gè)體,將Emp10定位至64.5kb區(qū)間內(nèi)。根據(jù)候選基因的序列及差異表達(dá)分析,確定5’UTR和exon1丟失了431bp且在emp10中幾乎不表達(dá)的候選基因GM16即為Emp10。Emp10編碼含有10個(gè)PPR基序的P型PPR蛋白。進(jìn)化分析表明,EMP10在高粱中的同源基因?yàn)镾obic.001g092300。3、Emp10的表達(dá)與定位。表達(dá)譜分析表明,Emp10屬于組成型表達(dá)基因,在雌穗和籽粒中的表達(dá)較高。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,EMP10特異地靶向線粒體。4、Emp10的作用機(jī)理。通過分析線粒體基因的轉(zhuǎn)錄本,檢測到在emp10中線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體I的重要亞基nad2 intron1沒有被剪切。BN-PAGE結(jié)果顯示,復(fù)合體I在emp10中不能正常組裝,NADH脫氫酶染色結(jié)果顯示emp10中復(fù)合體I活性幾乎完全喪失。透射電鏡結(jié)果顯示emp10中線粒體出現(xiàn)嵴斷裂降解,即線粒體結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。與此同時(shí),交替氧化酶途徑的重要基因AOX2和AOX3在emp10中被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。上述所有結(jié)果表明,Emp10功能缺失,導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈的氧化磷酸化途徑受損,受精后的籽粒發(fā)育所需能量不能正常供應(yīng),導(dǎo)致種子發(fā)育遲緩并出現(xiàn)空皮籽粒。5、ter1精細(xì)定位。從大芻草與玉米自交系Zong3的BC_2F_7群體中分離出的有柄小穗退化、穗行數(shù)減少的材料Ter1,Ter1表現(xiàn)出部分顯性,將Ter1與玉米自交系C01雜交,構(gòu)建了包含3822個(gè)單株的F_2分離群體,從中篩選到16個(gè)重組類型,通過子代測驗(yàn)、純合重組系與純合非重組系試驗(yàn)驗(yàn)證,將ter1定位于標(biāo)記C4-M4之間約300 kb范圍內(nèi)。6、大芻草BAC庫篩選與測序分析。通過菌液PCR的方法從70656個(gè)BAC克隆中篩選到10個(gè)部分包含目標(biāo)片段的陽性克隆,選取a0085P23/a0131J09克隆進(jìn)行三代測序。測序結(jié)果顯示該區(qū)間在大芻草中只有約250 kb,與玉米參考基因組的差異主要集中在基因間區(qū)。候選區(qū)間在大芻草與玉米自交系B73中均包含2個(gè)候選基因Zm674和Zm675。7、ter1候選基因的結(jié)構(gòu)及表達(dá)分析。Zm674和Zm675均編碼跨膜蛋白,分別含有Tmemb_185A,RhaT跨膜結(jié)構(gòu)域,ZM674在C末端包含有C3HC4 Zinc finger結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析表明Zm674表達(dá)無差異,Zm675在Ter1中上調(diào)表達(dá)。8、ter1關(guān)鍵候選基因的鑒定。針對Zm674和Zm675兩個(gè)候選基因設(shè)計(jì)特異引物,在Zong3和Ter1之間測序分析,分析結(jié)果表明,Zm674編碼區(qū)只有一個(gè)SNP差異,并不改變編碼的氨基酸,而Zm675編碼區(qū)存在6個(gè)SNPs差異,導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生改變,其中第644位的SNP在大芻草與玉米中已基本固定。88.6%(163/181)的大芻草材料為A,97.3%(496/510)的玉米材料為G。9、載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化。分別構(gòu)建了Zm674和Zm675的CRISPR-Cas9基因編輯載體并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
【圖文】：

玉米產(chǎn)量性狀相關(guān)基因 Emp10 及 ter1 的定位與克隆第一章 前言 玉米的起源及重要性狀的馴化選擇研究進(jìn)展玉米(Zea mays L.ssp.mays) 是世界范圍內(nèi)種植最廣的作物，約 9000中南部巴爾薩斯河流域的原住民對當(dāng)?shù)氐囊吧壏N：類蜀黍/大芻 Parviglumis) 進(jìn)行馴化選擇而來(Piperno and Flannery 2001, Matsuok草與玉米的差異主要體現(xiàn)在株型（圖 1.1）與穗部性狀上（圖 1.2），個(gè)方面：（1）兩行 vs 四行甚至更多；（2）單個(gè)小穗 vs 成對小穗；（s 柔軟；（4）落粒 vs 不落粒；（5）初級側(cè)花序?yàn)樾刍ㄐ?vs 雌花序；（為長分支 vs 短分支(Doebley et al 1990)。

圖 1.2 大芻草與玉米雌穗上的差異的穗軸暴露在頂端。B, 大芻草雌穗穗軸節(jié)間和穎殼(Wan2 The ear phenotype differences between teosinte b (cb) exposed at top. B, Teosinte ear with the rachis interno過構(gòu)建玉米-大芻草分離群體，利用連鎖分位到玉米基因組不同的位置(Doebley et 狀受多個(gè)遺傳因子影響，如有柄小穗(PS, P則由主效基因及多個(gè)修飾因子決定，，如研工作者不懈努力，影響大芻草與玉米表型制分支和側(cè)支花序性別的 tb1 (Doebley et (Wills et al 2013)、控制穎殼由堅(jiān)硬變短變?nèi)崞诘?ZmCCT (Yang et al 2013) 等。通過同三個(gè)基因 Zmsh1-1、Zmsh1-5.1 和 Zmsh1
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S513

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 朱璨;一個(gè)玉米花序發(fā)育突變體的鑒定與初步遺傳分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

本文編號：2640490