【摘要】：豆科植物和根瘤菌之間的共生系統(tǒng)已經(jīng)有了廣泛的研究,共生關(guān)系的建立首先需要一系列的相互識別過程,隨即根瘤菌通過侵入線進(jìn)入植物細(xì)胞,伴隨著植物形態(tài)發(fā)育的改變例如皮層細(xì)胞的分裂和生長形成一個(gè)特化的器官:根瘤。一個(gè)成熟的有功能的根瘤中,根瘤菌能固定空氣中的氮轉(zhuǎn)化成氨供宿主植物利用,作為交換,植物為根瘤菌提供光合作用產(chǎn)生的碳源和氨基酸。近些年來,以豆科模式植物苜蓿(Medicago truncatula)和百脈根(Lotus japonicus)為研究對象,在宿主植物中鑒定了一系列與共生相關(guān)的基因,并初步建立了早期共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式圖。其中百脈根共生受體SymRK(symbiosis receptor-like kinase)在根瘤共生(root nodule symbiosis(RNS))中有重要功能,能調(diào)控根瘤菌的侵入過程,但其調(diào)控機(jī)制卻知之甚少。本室通過SymRK作為誘餌蛋白篩選百脈根AD-cDNA酵母文庫得到與之互作的一個(gè)有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)命名為SIP2(SymRK interaction protein 2),SIP2對侵入線和根瘤的形成都有非常重要的作用,首次發(fā)現(xiàn)MAPK級聯(lián)可能參與了共生信號途徑,但其分子機(jī)理仍不清楚,本論文以此為出發(fā)點(diǎn)尋找SIP2靶蛋白并對MAPK級聯(lián)調(diào)控共生信號途徑的機(jī)制展開研究:1.在已知SIP2能磷酸化擬南芥AtMPK6的基礎(chǔ)上,通過核苷酸序列比對百脈根基因組數(shù)據(jù)庫,找到與AtMPK6最為同源的基因,命名為百脈根LjMPK6。通過酵母雙雜分析發(fā)現(xiàn)SIP2能與LjMPK6特異性相互作用,且這種互作依賴于SIP2的自磷酸化活性。體外磷酸化分析證明LjMPK6是SIP2的磷酸化底物。2.組織特異性和時(shí)空表達(dá)分析表明LjMPK6在所有檢測的組織中都有表達(dá),且表達(dá)受根瘤菌和結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)。啟動子表達(dá)分析和免疫熒光結(jié)果證明隨著根瘤菌的侵入,LjMPK6定位由根毛的頂端轉(zhuǎn)變?yōu)檠刂秩刖�、根瘤原基和成熟根瘤的薄壁組織和維管束。3.為了研究LjMPK6的生物學(xué)功能,從百脈根LORE1突變體庫中篩選的LjMPK6~(+/-)突變株的后代株系中并沒有篩選到純合突變體。進(jìn)一步通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對LjMPK6基因組序列進(jìn)行編輯,仍沒有獲得有效的編輯突變體。因此,通過RNAi技術(shù)下調(diào)表達(dá)LjMPK6進(jìn)而研究其在共生結(jié)瘤中的生物學(xué)功能,運(yùn)用根瘤特異性表達(dá)基因LjNAD1的啟動子下調(diào)表達(dá)LjMPK6并篩選出兩個(gè)獨(dú)立的T1代穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系,研究結(jié)果表明,沉默LjMPK6的表達(dá)后,根瘤密度和根瘤原基數(shù)目與對照植株比較顯著降低。為了進(jìn)一步證明LjMPK6在共生結(jié)瘤過程中起正調(diào)控作用,利用百脈根泛素啟動子過量表達(dá)LjMPK6,沒有獲得超量表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株。因此我們利用玉米泛素啟動子超表達(dá)LjMPK6并篩選出兩個(gè)獨(dú)立的T2代穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行共生表型分析,結(jié)果表明結(jié)瘤密度、侵入線數(shù)目和根瘤原基數(shù)目與對照植株比較都顯著提高。4.用LjMPK6作為誘餌蛋白篩選百脈根AD-cDNA酵母文庫,獲得與之相互作用的蛋白LHK1,并通過Y2H和CoIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了LjMPK6和LHK1的相互作用,且這種相互作用依賴于LHK1 receiver domain的活性。5.利用細(xì)胞分類素的一個(gè)輸出系統(tǒng)cytokinin two-component output sensor(TCS):GUS,檢測LjMPK6對細(xì)胞分裂素信號途徑的影響。在TCS:GUS穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株中通過毛根轉(zhuǎn)化超表達(dá)LjMPK6,結(jié)果表明超表達(dá)LjMPK6后GUS活性顯著降低。檢測能受細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)表達(dá)的乙烯合成酶的表達(dá),結(jié)果表明LjMPK6能部分抑制ACS1和ACS2的表達(dá),且這種抑制依賴于細(xì)胞分裂素受體LHK1。通過對乙烯含量的測定,超表達(dá)LjMPK6穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株接種根瘤菌后乙烯含量與對照比較顯著降低,而LjMPK6 RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株接種根瘤菌后乙烯含量與對照比較顯著上調(diào)。6.體外蛋白競爭結(jié)果表明LjMPK6能與LHP1競爭性結(jié)合LHK1 receiver domain。體外磷酸化研究進(jìn)一步證明LjMPK6能部分抑制LHK1對LHP1的磷酸化水平。
【圖文】：

生固氮效率卻不盡相同，通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)豆科植物根瘤中的根瘤菌生長狀態(tài)明顯好于P. andersonii中根瘤菌生長狀態(tài)(Op den Camp et al 2012)。圖1 根瘤共生侵入線和根瘤形成示意圖(Ferguson et al 2010)Figure 1. Rhizobia infection and nodulation in legumes1.3 早期共生結(jié)瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以豆科模式植物百脈根和苜蓿為主要研究材料，對早期共生結(jié)瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行了一系列研究。為了建立根瘤共生關(guān)系，需要根瘤菌和豆科植物一系列信號識別過

合細(xì)胞分裂素，將信號傳遞至胞內(nèi)，通過胞內(nèi)kinase domain的His的自磷酸化將磷酰基團(tuán)轉(zhuǎn)移至receiver domain的Asp，，然后receiver domain將磷�；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到HPs的His位點(diǎn)，HPs通過與RRs直接相互作用將磷�；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至RR的Asp（圖5）(Tanaka et al2004, Dortay et al 2007, Punwani et al 2010, El-Showk et al 2013, Verma et al 2015)。因此，細(xì)胞分裂素信號途徑可以將信號從細(xì)胞膜傳遞進(jìn)細(xì)胞核，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。圖5 擬南芥細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑Figure 5. Cytokinin signaling pathway in Arabidopsis
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S541.6

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本文編號：2640476