【摘要】：硫是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營養(yǎng)元素。在自然界中,硫同化的代謝形式因物種而異。在植物中,轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)的硫酸鹽可被胞內(nèi)ATP硫酸化酶催化為腺苷-5'-磷酸(APS),APS可被還原形成亞硫酸鹽,也可在腺苷-5'-磷酰硫酸激酶(APSK)的催化下轉(zhuǎn)化為3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸(PAPS),提供硫酸基團(tuán)供體以修飾各種代謝物。APSK在植物中與APS還原酶共同競(jìng)爭(zhēng)硫同化途徑的一級(jí)和二級(jí)分支之間的硫酸鹽,其對(duì)植物的正常發(fā)育至關(guān)重要。盡管植物中硫酸化合物對(duì)植物發(fā)育有重要作用,且硫酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝機(jī)制研究成熟,但對(duì)于提供激活硫酸鹽供體PAPS的酶APSK 了解甚少。在擬南芥中鑒定了四種的APSK。根據(jù)APSK在擬南芥中的定位和功能,發(fā)現(xiàn)APSK1和APSK 2在硫酸化代謝物的合成中起主要作用。APSK1主要調(diào)節(jié)硫的初級(jí)和次級(jí)代謝過程,并且受到氧化脅迫的APSK1在C86和C119之間形成二硫鍵會(huì)降低其催化活性。通過對(duì)APSK序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)水稻APSK1含有與擬南芥APSK C86和C1 19同源的半胱氨酸。我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究已經(jīng)表明氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠明顯減少野生型水稻APSK1的活性,而C36A和C69A的雙重突變能夠緩解這種氧化作用。水稻APSK的序列和三維模擬結(jié)構(gòu)分析顯示C77,C168,C212也易被氧化,而且很可能也在其活性調(diào)節(jié)中起作用。本研究中,我們利用水稻APSK1基因作為模板,分別構(gòu)建了 C77A,C168A和C212A的突變體。用原核表達(dá)的突變體在還原和氧化環(huán)境下進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表明,在DTT存在下,C77A,C168A和C212A的kcat分別降低到21.3%,9.1%和9.9%,Km分別降低到野生型酶的2.6%,12.2%和20.2%,Kiaps被發(fā)現(xiàn)顯著增加。在氧化條件下,C77A,C168A和C212A的kcat分別下降到野生型的36.2%,22.6%和38.2%,Km降低到1.8%,6.1%和5.9%,Kiaps上升到野生型的328%,745%和655%。說明除C36和C69在其活性調(diào)控中發(fā)揮重要作用外,C77A,C168A和C212A還可能涉及活性調(diào)節(jié),特別是在氧化條件下。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析可能提供更多的見解很多酶在高溫條件下就會(huì)失去活性,但絕大部分的嗜熱酶在此環(huán)境中仍能保持較高的催化活性,因此嗜熱酶的研究和開發(fā)也是目前市場(chǎng)上的熱點(diǎn),嗜熱菌就是當(dāng)前獲得嗜熱酶最直接和可靠的來源。硫酸鹽在次級(jí)代謝轉(zhuǎn)化途徑中形成分支點(diǎn),一些致病細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌主要通過APS還原酶將APS還原成亞硫酸鹽,提供了將硫合成各種代謝物的主要途徑。相比之下,其他細(xì)菌,真菌和人類依次使用APSK和APS還原酶在初級(jí)硫同化途徑中將APS轉(zhuǎn)化為PAPS,然后通過PAPS還原酶進(jìn)一步代謝生成亞硫酸鹽。在實(shí)驗(yàn)室的前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)蒼白空氣芽孢桿菌為中度嗜熱菌(Aeribacilluspallidus,最適生長(zhǎng)溫度為50℃),可以分泌抑菌活性物質(zhì),并且我們已經(jīng)完成其基因組測(cè)序工作(未發(fā)表結(jié)果)。在本研究中,我們克隆并表達(dá)了蒼白空氣芽孢桿菌的APSK基因,并對(duì)其進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明嗜熱菌APSK的最適pH為8.0,這與水稻、擬南芥等植物APSK的最適pH類似;嗜熱菌APSK的最適反應(yīng)溫度為25℃,有意思的是在嗜熱菌(A.pallidus JH-7)的最適生長(zhǎng)溫度50℃時(shí)APSK的活性較低,這說明在最適生長(zhǎng)條件下此酶活性在較大程度上受到溫度的影響。本次的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)得嗜熱菌APSK的KmAPS、KcatAPS分別為10.25 μM/L和62.87/s,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于擬南芥及水稻APSK的KmAPS和KcatAPS值,但是其催化效率Vm/Km(s-1·μM-1)相差并不大。APSK功能上的保守性說明APSK活性在嗜熱菌生長(zhǎng)發(fā)育過程中同樣發(fā)揮重要的功能。
【圖文】：

還原形成亞硫酸和Ｓ２－［１７’邋１８］，最后整合成半胱氨酸；也可在腺苷－５＇－磷酰硫酸激酶逡逑（ＡＰＳＫ）的催化下生成３邋Ｉ－磷酸－腺苷５邋磷酰硫酸（ＰＡＰＳ），ＰＡＰＳ作為硫酸化反應(yīng)逡逑的硫供體參與調(diào)節(jié)化合物的生理功能及蛋白間的互作（圖１）［１９］。硫代葡萄糖苷是逡逑多種植物的次生代謝物，因其合成過程中的硫酸化反應(yīng)需要ＰＡＰＳ作為供體，所以逡逑突變ＡＰＳＫ會(huì)導(dǎo)致硫代葡萄糖苷合成量降低Ｗ２１］。作為硫還原途徑主要產(chǎn)物之一逡逑的谷胱甘肽，在細(xì)胞內(nèi)具有多種功能；參與維持胞內(nèi)的氧化還原平衡及細(xì)胞的解毒逡逑及螯合重金屬過程。并且ＡＰＳＫ及ＡＰＳ還原酶（ＡＰＳＲ）的活性比例直接影響到還原逡逑谷胱甘肽的合成，這在很大程度上也影響著植物的抗病、抗逆性能［１７＿邋２２］。逡逑硫是所有活生物體的必需元素，是生物合成多種代謝物和大分子所必需的。逡逑硫元素經(jīng)細(xì)胞膜上的硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入植物細(xì)胞，以硫酸鹽的形式運(yùn)輸和儲(chǔ)逡逑３逡逑

APSK突理
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S511

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2636252