【摘要】：竹黃菌為我國傳統(tǒng)重要的藥用真菌,其活性產(chǎn)物為竹紅菌素,該物質(zhì)能被激發(fā)產(chǎn)生活性氧,損傷細(xì)胞大分子物質(zhì),誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此,竹紅菌素常被作為光敏劑,應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。鑒于其重要應(yīng)用前景和理論研究價值,國內(nèi)外專家近幾十年來分別對竹紅菌素進(jìn)行了產(chǎn)量優(yōu)化、純化、應(yīng)用等方面的研究。目前,仍缺乏有效的竹黃菌分子操作手段,致使竹紅菌素的合成機(jī)制研究甚少。此外,在高產(chǎn)竹紅菌素的條件下,該菌仍能抵御氧化脅迫,維持良好的生理形態(tài),但其抗氧化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),仍未見系統(tǒng)的報道。本課題以竹黃菌Shiraia sp.SUPER-H168為出發(fā)菌株,建立了該宿主基因相對表達(dá)分析平臺、表達(dá)與敲除系統(tǒng),探討了參與竹紅菌素合成的關(guān)鍵性基因,解析了竹黃菌抵御外界環(huán)境及自身毒性產(chǎn)物的抗氧化系統(tǒng),主要結(jié)論如下。(1)構(gòu)建了穩(wěn)定的竹黃菌基因相對表達(dá)分析平臺在竹紅菌素生產(chǎn)與缺失的2種培養(yǎng)條件下,分析竹黃菌9個內(nèi)參基因穩(wěn)定性及表達(dá)豐度。這些內(nèi)參基因包括肌動蛋白(actin,Act),檸檬酸合成酶A(citrate synthase A,CsA),檸檬酸合成酶B(citrate synthase B,CsB),細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,CyO),磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase,PhoK),丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase,PyrD),微管蛋白(tubulin,Tub),18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)等基因。GerNorm輸出結(jié)果顯示:Tub與Act基因穩(wěn)定性較弱,不適宜于后期基因相對表達(dá)水平分析,CyO與GAPDH穩(wěn)定性較好,NormFinder軟件得出類似的結(jié)果。隨后,運(yùn)用GeNorm分析備選內(nèi)參基因的成對變異值(V_n/_(n+1)),確定最優(yōu)的內(nèi)參基因組合。其中,V_(2/3)值為0.119,小于閾值0.15�；贑yO與GAPDH內(nèi)參基因?yàn)榉�(wěn)定性最好的2個內(nèi)參基因,因此,確定用該組合內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)歸化竹黃菌其余基因的相對表達(dá)水平。以竹紅菌素合成相關(guān)的聚酮合酶為目標(biāo)基因,確定該方法歸化基因相對表達(dá)水平可靠性較好,可將該方法用于竹黃菌其余基因相對表達(dá)水平分析。(2)建立了竹黃菌表達(dá)系統(tǒng)以山梨醇為穩(wěn)滲劑,萌發(fā)的竹黃菌孢子為出發(fā)材料,裂解酶、β-葡萄糖醛酸酶、崩潰酶等為破壁酶,得到高質(zhì)量的竹黃菌原生質(zhì)體。用聚乙二醇/CaCl_2轉(zhuǎn)化法,轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒至原生質(zhì)體,在潮霉素抗性平板上,篩選出陽性克隆子。含過表達(dá)質(zhì)粒的竹黃菌呈現(xiàn)出綠色熒光蛋白信號,在野生竹黃菌中未檢測到此熒光蛋白信號。運(yùn)用GAPDH啟動子啟動綠色熒光蛋白,根據(jù)熒光蛋白信號強(qiáng)弱,篩選合適的GAPDH啟動子長度。其中,約為2000 bp的GAPDH啟動子呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號,可用于后期竹黃菌基因的表達(dá)。(3)建立了竹黃菌CRISPR敲除系統(tǒng)野生型竹黃菌與不同CRISPR質(zhì)粒的竹黃菌(含Cas9質(zhì)粒、sgRNA質(zhì)粒)的菌落形態(tài)、生物量及竹紅菌素色素產(chǎn)量無明顯差異,CRISPR元件對竹黃菌無毒性,可用于后期基因編輯研究。選取竹紅菌素全局調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子為靶向基因,建立竹黃菌敲除系統(tǒng)。為提高敲除效率,制備了同源臂序列,并與敲除質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至原生質(zhì)體,敲除效率提高至23.07%。隨后,進(jìn)一步優(yōu)化竹黃菌內(nèi)源性U6啟動子,啟動sgRNA序列。其中,采用竹黃菌U6-1與U6-3啟動子時,敲除效率略微提升,分別為27.27%與33.33%;采用竹黃菌U6-2啟動子時,敲除效率為20%。(4)探究竹紅菌素合成的關(guān)鍵性基因運(yùn)用antiSMASH生物信息學(xué)軟件預(yù)測出竹紅菌素合成相關(guān)的關(guān)鍵性基因,采用基因相對表達(dá)水平工具初步驗(yàn)證聚酮合成酶、單加氧化酶、轉(zhuǎn)錄因子等基因相對表達(dá)水平與竹紅菌素合成呈正相關(guān)。運(yùn)用CRISPR系統(tǒng)敲除這3個基因,敲除菌株均不再生產(chǎn)竹紅菌素。相對于野生型菌株,在這3種敲除菌株中,參與竹紅菌素代謝途徑基因的相對表達(dá)水平均顯著降低。此外,竹紅菌素代謝途徑的多銅氧化酶過表達(dá)后,該漆酶基因表達(dá)量增加了近5倍,該代謝途徑聚酮合酶、單加氧化酶等基因的相對表達(dá)量增加了7倍以上,基因簇調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄因子提高了9.69倍。多個竹紅菌素合成基因的表達(dá)量提高,保證了竹紅菌素產(chǎn)量提高到3.18 g·L~(-1),相對于野生型菌株,產(chǎn)量提高了5倍。(5)解析了竹黃菌的抗氧化系統(tǒng)經(jīng)氧化脅迫的刺激,竹黃菌中超氧化物歧化酶酶活迅速增強(qiáng),保證過多的超氧自由基轉(zhuǎn)化為無毒性的H_2O。過氧化氫酶產(chǎn)量也顯著提高,在72 h后,仍處于較高的水平,保證過多的H_2O_2轉(zhuǎn)化為無毒性的H_2O。高濃度的H_2O_2處理初期,竹黃菌谷胱甘肽過氧化物酶的酶活減少,48 h后,含量迅速提高,促使H_2O_2轉(zhuǎn)化為無毒性H_2O。經(jīng)H_2O_2誘導(dǎo),處理組竹黃菌中還原性谷胱甘肽含量明顯增強(qiáng),即使96 h后,GSH含量也維持在較高的水平。GSH與竹黃菌谷胱甘肽過氧化物酶協(xié)同作用,將外源的H_2O_2迅速催化為H_2O。此外,經(jīng)基因敲除與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn),竹紅菌素合成途徑中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(major facilitator superfamily,MSF transporter)將竹紅菌素轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外,減少竹紅菌素產(chǎn)生的氧化壓力。綜上所述,竹紅菌素來源的氧化脅迫可刺激竹黃菌抗氧化系統(tǒng),使其維持正常的氧化還原水平,保證該物質(zhì)連續(xù)合成。
【圖文】：

圖 1-1 竹紅菌素的用途Fig. 1-1Applications of the hypocrellin菌素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用菌素在光和氧激發(fā)下，產(chǎn)生活性氧，損傷細(xì)胞 DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，竹紅菌素能作為一種生物殺蟲劑。殷紅福[20]等人研究發(fā)現(xiàn)：竹紅菌多種植物病原菌，尤其對松針褐斑（Lecanosticta acicola）、鐮刀菌rumSchwabe）、蘋果腐爛病菌（ValsamaliMiyabeetYamada）、山核桃ophomacaryae）高達(dá) 90%以上的抑制率。此外，竹紅菌甲素對眾多蟲等）均有殺滅效果。菌素在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用菌甲素與竹紅菌乙素在光激活條件下能產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧�；诒挥米鞴饷魟瑥V泛應(yīng)用到醫(yī)藥領(lǐng)域。例如，竹紅菌素可作為潛在管疾病或皮膚病，如瘢痕疙瘩、白癜風(fēng)、銀屑病、頭癬、淀粉樣變苔蘚也呈現(xiàn)出抗菌、抗癌、抗病毒的生物活性，尤其在治療艾滋eficiency virus，HIV）領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注[23]。

江南大學(xué)博士學(xué)位論文5 傒醌類生產(chǎn)菌株的抗氧化系統(tǒng)光敏性傒醌類化合物經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生超氧自由基與單線態(tài)氧等活性氧，損傷細(xì)胞大分發(fā)細(xì)胞凋亡。值得注意的是，該光敏劑經(jīng)光激發(fā)轉(zhuǎn)化為帶電子的三重態(tài)，，隨后，與反應(yīng)。該反應(yīng)包括兩種類型：（1）在還原性底物存在時，三重態(tài)的光敏劑參與電子反應(yīng)（Ⅰ型反應(yīng)），生成自由基，如超氧化物與 H2O2等。（2）三重態(tài)的光敏劑也可通 O2直接反應(yīng)，形成單線態(tài)氧（Ⅱ型反應(yīng)）。在傒醌類化合物合成過程中，產(chǎn)生的活等物質(zhì)常造成宿主脂質(zhì)氧化、膜損傷，進(jìn)而引發(fā)營養(yǎng)物質(zhì)從胞內(nèi)滲透到胞外。因醌類化合物具有廣譜的毒性，對植物、動物、微生物等均有毒害作用[34]。另一方醌類化合物的生產(chǎn)菌株具有自身抗氧化系統(tǒng)，抵御毒性產(chǎn)物的危害，保證其正常的活動持續(xù)進(jìn)行（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 殷紅福;光敏化合物竹紅菌素抑菌殺蟲作用研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2011年

本文編號：2632508