發(fā)布時(shí)間：2020-04-15 04:55

【摘要】：外源DNA導(dǎo)入是創(chuàng)造新種質(zhì)、培育新品種的一種新途徑,通過將外源DNA導(dǎo)入到植物種質(zhì)系統(tǒng)的細(xì)胞,獲得突變材料,并篩選出具有某些目的性狀的新種質(zhì)和新品種。本實(shí)驗(yàn)室利用改良的“花粉管介導(dǎo)法”,將玉米DNA導(dǎo)入水稻“日本晴”,獲得了一批突變株,經(jīng)多代自交選育,至第八代選育出與日本晴農(nóng)藝性狀有明顯差異的基本穩(wěn)定遺傳的變異株系,命名為RMIM91(以下簡(jiǎn)稱R91)。對(duì)R91進(jìn)行全基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和激素信號(hào)傳導(dǎo)通路分析,結(jié)果表明:1、基因組測(cè)序結(jié)果中檢測(cè)到大量突變位點(diǎn),與水稻數(shù)據(jù)庫和對(duì)照基因組數(shù)據(jù)比對(duì)后,篩選獲得R91特有突變位點(diǎn)共200,479處,包括103,314處SNP和97,165處In Del,說明外源DNA對(duì)水稻基因組DNA誘變效果明顯。2、R91特有SNP突變中發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換有62,647處,堿基顛換有40,667處,InDel突變包括61,816處插入和35,348處缺失,說明R91中轉(zhuǎn)換頻率大于顛換頻率,插入突變多于缺失突變。3、R91基因組堿基發(fā)生突變的頻率由高到低為:G(30.76%)C(30.28%)A(19.59%)T(19.37%),說明在R91中G和C是易突變堿基。4、SNP突變位點(diǎn)中,臨側(cè)堿基為PuNPu的突變位點(diǎn)有26,453處,為PyNPy的突變位點(diǎn)共有26,314處,臨側(cè)堿基為PuNPyPyNPu的位點(diǎn)共有50,545處,其中臨側(cè)堿基為CNG的突變位點(diǎn)有8,610處,突變頻率最高,表明在臨側(cè)堿基為C和G時(shí)堿基更容易發(fā)生突變。5、SNP突變發(fā)生在基因關(guān)鍵位點(diǎn)的共43處(基因啟動(dòng)子缺失突變1處、終止子突變17處、剪接區(qū)突變4處),有5處突變位點(diǎn)在R91下代基因組中重新檢出。已知功能基因及上下游共檢測(cè)到34處SNP突變,分別位于10個(gè)基因上,有4處影響蛋白編碼,其中2處突變位點(diǎn)在R91下代基因組中重新檢出。這表明全基因組測(cè)序檢出的突變位點(diǎn)在R91中確實(shí)存在,外源DNA導(dǎo)入能誘導(dǎo)水稻基因組發(fā)生SNP突變。6、位于基因關(guān)鍵位點(diǎn)的InDel突變有986處,其中插入有613處,缺失374處;插入和缺失堿基變化范圍主要分布在-2~2個(gè)堿基,說明InDel突變主要為3堿基以下的插入和缺失。7、從InDel突變中篩選出25個(gè)In Del位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),有14個(gè)突變位點(diǎn)在R91下代被重新檢測(cè)到;已知功能基因及上下游的In De突變位點(diǎn)有53處,共影響到18個(gè)基因,經(jīng)檢測(cè)有6處突變位點(diǎn)在R91下代重新檢出。這表明外源DNA導(dǎo)入能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生InDel突變。8、R91下代揚(yáng)花期劍葉和莖節(jié)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,部分突變基因的表達(dá)水平較日本晴有顯著變化:R91中被沉默的基因有Os06g0240400和Os12g0116200,被激活表達(dá)的基因有Os05g0309000和Os06g0246200;Os01g0686200基因在莖節(jié)和劍葉表達(dá)水平均上調(diào),Os09g0567000基因在莖節(jié)和劍葉表達(dá)水平均下調(diào),Os05g0390500和Os08g0193300基因僅在莖節(jié)表達(dá)上調(diào),Os05g0309000僅劍葉表達(dá)上調(diào),Os10g0126500基因僅莖節(jié)表達(dá)下調(diào)。表明外源DNA導(dǎo)入誘發(fā)的突變可以影響水稻基因揚(yáng)花期的表達(dá)水平。9、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明,27處重檢出的突變位點(diǎn)中,有7處破壞了蛋白的功能結(jié)構(gòu),說明外源DNA導(dǎo)入引起的突變可以對(duì)蛋白功能造成較大影響。10、功能富集聚類分析中,乙烯和脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)通路中部分基因表達(dá)水平差異顯著,表明外源DNA導(dǎo)入誘發(fā)的突變對(duì)這兩個(gè)激素信號(hào)傳導(dǎo)通路有影響。以上結(jié)果表明,外源DNA導(dǎo)入是一種有效的生物誘變技術(shù),可以誘導(dǎo)水稻基因組發(fā)生大量SNP突變和插入缺失突變,以及少部分外源DNA序列的插入,改變水稻的基因序列,對(duì)基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及基因表達(dá)水平有重大影響。研究中發(fā)現(xiàn)的易突變堿基和易突變位點(diǎn),為研究水稻基因突變的分子機(jī)理提供理論依據(jù);誘變引發(fā)的多種突變性狀,對(duì)新基因發(fā)掘和功能基因研究、新種質(zhì)資源的創(chuàng)制和利用有重要意義。
【圖文】：

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析流程

R91部分變異性狀注：a為CK與R91株型對(duì)比，，標(biāo)尺20cm；b、c、d分別為R91氣生根、紫莖、高位分蘗
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S511

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