【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)是異源六倍體的單子葉禾本科作物,是人類(lèi)膳食中營(yíng)養(yǎng)元素的主要來(lái)源。由于小麥龐大冗雜的基因組及其對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的頑抗,導(dǎo)致小麥中微量營(yíng)養(yǎng)元素的基因工程改善滯后于其他作物。維生素E(Vitamin E)是動(dòng)植物機(jī)體中的抗氧化劑之一。由于人體不能直接合成維生素E,所以其來(lái)源一般都從蔬菜或植物壓榨油中獲得。維生素E可以清除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧自由基,參與抵抗脂質(zhì)的過(guò)氧化,對(duì)植物體的抗逆信號(hào)產(chǎn)生響應(yīng)。維生素E的組成主要包括生育酚和生育三烯酚,它們又各包含α、β、γ和δ四種亞型。生育三烯酚顯示出與生育酚非常不同的健康益處,并且在大多數(shù)情況下,這些活性對(duì)于人類(lèi)使用來(lái)說(shuō)積極的。本論文以小麥品種科農(nóng)199(KN199)為研究對(duì)象,通過(guò)PCR技術(shù)克隆出維生素E合成代謝通路的尿黑酸r{牛兒基r{牛兒基轉(zhuǎn)移酶基因HGGT,并取得如下進(jìn)展:1.通過(guò)生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)TaHGGT-7AL基因序列組成、同源比對(duì)及不同物種HGGT蛋白進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建進(jìn)行了初步的分析。結(jié)果表明TaHGGT-7AL為疏水性蛋白,基因的CDS長(zhǎng)度為1227 bp,并且編碼了408個(gè)氨基酸,三級(jí)結(jié)構(gòu)有9個(gè)跨膜螺旋。三條序列的一致性為95.45%,禾本科HGGT蛋白的同源性在58.7%-98.5%之間。TaHGGT基因分別位于小麥基因組的7AL、7BL和7DL染色體上,都具有與膜相關(guān)的UbiA異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族的保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽。同源進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示,TaHGGT-7AL與大麥、水稻等禾本科植物劃為一支。2.通過(guò)Primer 5和PCR技術(shù),設(shè)計(jì)引物克隆出HGGT基因在小麥A、B、D基因組上的拷貝,在小麥表達(dá)量數(shù)據(jù)庫(kù)分析得知位于染色體7AL的HGGT基因表達(dá)量最高,并使用一步克隆法將TaHGGT-7AL基因構(gòu)建至胚乳特異表達(dá)載體(pHMW-HGGT)與廣譜表達(dá)載體(pUbi-HGGT)。3.利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù),將pHMW-HGGT與pUbi-HGGT載體轉(zhuǎn)化至小麥幼胚,PCR驗(yàn)證分別得到4/2株T_0代陽(yáng)性植株;繼續(xù)種植T_1代,PCR驗(yàn)證分別得到19株/6株陽(yáng)性植株。4.通過(guò)NCBI小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)本地比對(duì),并且設(shè)計(jì)針對(duì)TaHGGT-7AL基因的特異性引物,經(jīng)過(guò)qRT-PCR分析得知,Ubi載體轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性植株,其HGGT基因的表達(dá)量最高是野生型小麥的3.9倍。HMW載體的轉(zhuǎn)化小麥,其HGGT的相對(duì)表達(dá)量最高是未轉(zhuǎn)化植株的6.8倍。在過(guò)表達(dá)TaHGGT-7AL基因之后,對(duì)維生素E合成代謝通路的上下游基因也是有影響的。其中處于上調(diào)的基因有HPT、TC與γ-TMT;下調(diào)的基因?yàn)镠PPD;MT基因的相對(duì)表達(dá)量變化不大。5.分析維生素E上游關(guān)鍵基因TaHGGT-7AL,在小麥籽粒中對(duì)ABA、PEG、低溫(4℃)、鹽(NaCl)與暗等非生物脅迫后產(chǎn)生不同的響應(yīng)。TaHGGT-7AL基因在上述脅迫24小時(shí)之內(nèi),表達(dá)量整體呈上調(diào)趨勢(shì)。6.陽(yáng)性小麥株籽粒的丙二醛(MDA)含量明顯低于未轉(zhuǎn)化的小麥植株。HMW載體轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性植株,其籽粒MDA的含量極顯著低于野生型小麥。通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化的小麥籽粒比未轉(zhuǎn)化的小麥籽粒大。
【圖文】：

圖 2-1 玉米泛素化（Ubi）與胚乳特異（HMW）表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the construction of maize ubiquitination (Ubi) and endosperm specific(HMW) expression vector.2.15 基因槍法轉(zhuǎn)化小麥采用基因槍法轉(zhuǎn)化（聞珊珊 2012）。本研究作為轉(zhuǎn)基因受體小麥材料為科農(nóng) 1科農(nóng) 199 花后 14 天未成熟種子，將其胚與胚乳剝離，用其胚做小麥基因槍轉(zhuǎn)化試圖 2-2）。具體步驟如下：) 在溫室培養(yǎng)小麥至花后 10 天，注意防止病蟲(chóng)害，將麥穗剪下置于冰箱（4℃）一；) 剝下麥穗上的籽粒，用 75%的乙醇溶液噴洗籽粒消毒；) 將消毒過(guò)的籽粒置于超凈臺(tái)；) 用無(wú)菌的鑷子及刀片剝下籽粒中的胚，將胚正向小心置于培養(yǎng)基，放到人工氣候培養(yǎng) 20 天左右；) 把愈傷組織夾到甘露醇培養(yǎng)基中心直徑 4 厘米左右的范圍，以備基因槍轟擊實(shí)

圖 2-2 小麥轉(zhuǎn)基因流程Fig. 2-2 The process of transgenic wheat2.2.16 小麥基因組 DNA 的提取小麥基因組（gDNA ）的提取采用 CTAB 法。（1）將幼苗葉片放入用液氮冷卻后的研缽，再迅速加入液氮，用研缽棒將葉片研磨至細(xì)粉末，并用不銹鋼藥勺將粉末刮入 2 ml 的 EP 管中；（2）使用移液槍?zhuān)?750 μL 預(yù)熱的 CTAB（65 ℃）溶液，并小心加入 2 ml 的 EP管中，在渦旋機(jī)上逐個(gè)渦旋 1 0s 或至混勻；（3）將 2 ml 的 EP 管擺整齊至 96 孔板，然后放入 65℃烘箱中 30 min；（4）將 2 ml 的 EP 管放置于室溫的試驗(yàn)臺(tái) 2 min，，然后用排槍加入預(yù)冷的（4℃）氯仿/異戊醇（750 μL）溶液；（5）將 96 孔板上 EP 管混勻 1 min 后在 4 ℃的離心機(jī)下中，10000 rpm 離心 15 min；（6）將 2 ml 的 EP 管拿出離心機(jī)，并將其中的上清液，用移液槍吸取 300μL，加到高溫滅菌過(guò)的 1.5 mL 的 EP 管中；（7）加入 600 μL 預(yù)冷的（-20 ℃）95%乙醇溶液；
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S512.1

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本文編號(hào)：2616069