【摘要】：陽春砂(Amomum villosum Lour.)來源于姜科豆蔻屬,是多年生常綠草本植物,以其干燥成熟的果實(shí)春砂仁入藥,是著名的“四大南藥”之一,具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效,為傳統(tǒng)的大宗常用中藥材,已有1300多年的應(yīng)用歷史。由于陽春砂特殊的花器官結(jié)構(gòu)——假合蕊柱,阻礙了蜜蜂等媒介為之授粉,導(dǎo)致陽春砂的自然結(jié)實(shí)率極低,僅為1.17%,嚴(yán)重的限制了春砂仁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。道地產(chǎn)區(qū)陽春市多采用人工授粉以提高產(chǎn)量,但人工授粉勞動(dòng)強(qiáng)度高,而且即使通過人工授粉平均畝產(chǎn)仍不足5 kg,這抑制了農(nóng)戶種植的積極性。如果能人為改變陽春砂的花器官結(jié)構(gòu),使蜜蜂等蟲媒可以幫助授粉,提高自然授粉率,從而提高陽春砂的產(chǎn)量,將有利于擴(kuò)大春砂仁的生產(chǎn),解決當(dāng)前供不應(yīng)求的市場(chǎng)現(xiàn)狀,同時(shí)減少生產(chǎn)種植成本,提高農(nóng)民的收入。本課題組陳紅研究發(fā)現(xiàn),陽春砂的假合蕊柱結(jié)構(gòu)是在陽春砂小花生長(zhǎng)發(fā)育過程中雌雄蕊的相對(duì)運(yùn)動(dòng)形成的。因此,本文在陳紅的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究陽春砂花絲、花柱的運(yùn)動(dòng)機(jī)理,以期為改變陽春砂花器官結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ),為提高陽春砂自然授粉率提供理論根據(jù)。研究結(jié)果如下:(1)研究了陽春砂花絲、花柱運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和運(yùn)動(dòng)發(fā)生的部位以及時(shí)間采用陳紅建立的陽春砂小花生長(zhǎng)時(shí)期的劃分標(biāo)準(zhǔn),按照長(zhǎng)度從0.5 cm的小花開始,每伸長(zhǎng)0.5 cm為一個(gè)時(shí)期,至開花后一天共劃分為0~7個(gè)不同的生長(zhǎng)時(shí)期:第0時(shí)期、第1時(shí)期、第2時(shí)期、第3時(shí)期、第4時(shí)期、第5時(shí)期、第6時(shí)期、第7時(shí)期。第6時(shí)期為開花當(dāng)天,第7時(shí)期為花后一天。通過制作不同生長(zhǎng)時(shí)期的花絲、花柱的石蠟切片,測(cè)定了花絲和花柱在不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞大小和分布。發(fā)現(xiàn)陽春砂花絲的運(yùn)動(dòng)是由于花絲遠(yuǎn)近軸側(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的不平衡導(dǎo)致的,并且這種運(yùn)動(dòng)是從花絲形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端依次發(fā)生的。0~3時(shí)期,花絲各部位遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞基本均大于近軸側(cè),且超過近軸側(cè)3.52%~56.00%;到了第4時(shí)期和第5時(shí)期,花絲部位4、5近軸側(cè)的細(xì)胞比遠(yuǎn)軸側(cè)大7.15%~29.84%;到了第6時(shí)期,花絲近軸側(cè)各部位的細(xì)胞大小均大于遠(yuǎn)軸側(cè),且超過遠(yuǎn)軸2.24%~21.38%,花絲已經(jīng)完全由近軸側(cè)向遠(yuǎn)軸側(cè)彎曲。因此,花絲的彎曲運(yùn)動(dòng)是由于遠(yuǎn)近軸側(cè)細(xì)胞增大的速率不平衡導(dǎo)致的,運(yùn)動(dòng)發(fā)生時(shí)間主要始于第3~4時(shí)期,運(yùn)動(dòng)發(fā)生的部位始于形態(tài)學(xué)上端的部位4和部位5,逐漸向形態(tài)學(xué)下端延伸。陽春砂花柱的運(yùn)動(dòng)是由于花柱遠(yuǎn)近軸側(cè)細(xì)胞的分布以及生長(zhǎng)速率的不平衡導(dǎo)致的�；ㄖh(yuǎn)近軸側(cè)的結(jié)構(gòu)是不對(duì)稱的,近軸側(cè)比遠(yuǎn)軸側(cè)多了4~6層較大的薄壁細(xì)胞。在小花生長(zhǎng)發(fā)育的全過程中,同一部位近軸側(cè)細(xì)胞均顯著大于遠(yuǎn)軸側(cè)。不同時(shí)期部位1、2、3遠(yuǎn)近軸側(cè)細(xì)胞大小相差不大;部位4、5近軸側(cè)細(xì)胞比遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞大25.36%~115.99%。小花在第3~4時(shí)期開始,部位5遠(yuǎn)近軸側(cè)細(xì)胞迅速增大,近軸側(cè)細(xì)胞增大71.67%,遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞增大25.04%;到了第5~6時(shí)期,部位4近軸側(cè)細(xì)胞迅速增大31.92%,遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞增大18.33%,部位4、5近軸側(cè)細(xì)胞增大的速率均大于遠(yuǎn)軸側(cè),導(dǎo)致花柱近軸側(cè)生長(zhǎng)速率大于遠(yuǎn)軸側(cè),并且由近軸側(cè)向遠(yuǎn)軸側(cè)運(yùn)動(dòng)。因此,花柱由彎曲變直的過程也是起始于3~4時(shí)期,運(yùn)動(dòng)發(fā)生的部位主要在部位4和部位5。遠(yuǎn)近軸側(cè)細(xì)胞形態(tài)的不對(duì)稱是其運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ),細(xì)胞生長(zhǎng)速率的不平衡是其運(yùn)動(dòng)的根本原因。(2)研究了四種植物激素在花絲、花柱中的分布和相對(duì)含量通過免疫組化的方法測(cè)定了不同生長(zhǎng)時(shí)期花絲、花柱中IAA、GA_3、CTK、ABA的相對(duì)含量和分布特性。3~4時(shí)期,花絲遠(yuǎn)近軸側(cè)IAA含量均顯著下降,近軸側(cè)下降了52.05%,遠(yuǎn)軸側(cè)下降了91.34%,遠(yuǎn)軸側(cè)IAA含量下降的速率遠(yuǎn)大于近軸側(cè),導(dǎo)致遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率小于近軸側(cè);遠(yuǎn)軸側(cè)CTK含量下降37.14%,而近軸側(cè)CTK含量?jī)H下降3.74%,遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞分裂能力迅速減弱,花絲近軸側(cè)細(xì)胞分裂活躍,細(xì)胞數(shù)目增多;近軸側(cè)GA_3相對(duì)含量上升了12.02%,而遠(yuǎn)軸側(cè)GA_3含量下降了7.05%,使近軸側(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速率大于遠(yuǎn)軸側(cè)。因此,可能是IAA、CTK、GA_3三者的共同作用,促進(jìn)了近軸側(cè)細(xì)胞體積的增大和細(xì)胞數(shù)目的增多,最終導(dǎo)致花絲從3~4時(shí)期開始,由近軸側(cè)向遠(yuǎn)軸側(cè)彎曲運(yùn)動(dòng)。1~3時(shí)期,花柱遠(yuǎn)軸側(cè)高濃度IAA、GA_3、ABA抑制了細(xì)胞體積的增大,導(dǎo)致遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞均小于近軸側(cè);但花柱遠(yuǎn)軸側(cè)高濃度的IAA和GA_3協(xié)同高濃度的CTK促進(jìn)了遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞分裂,使遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞數(shù)目增多且超過近軸側(cè),花柱呈現(xiàn)由遠(yuǎn)軸側(cè)向近軸側(cè)彎曲的形態(tài)。3~4時(shí)期開始,花柱近軸側(cè)IAA、GA_3和ABA下降到適宜的濃度,對(duì)近軸側(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用解除,而遠(yuǎn)軸側(cè)IAA和GA_3持續(xù)上升了21.61%和33.21%,對(duì)遠(yuǎn)軸側(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制增強(qiáng);近軸側(cè)CTK含量升高12.86%,且顯著高于遠(yuǎn)軸側(cè),使近軸側(cè)細(xì)胞分裂比遠(yuǎn)軸側(cè)活躍,細(xì)胞數(shù)目迅速增多;因此,可能是IAA、CTK、GA_3、ABA四者的共同作用,促進(jìn)花柱近軸側(cè)細(xì)胞體積增大和數(shù)目增多,使花柱近軸側(cè)快速伸長(zhǎng),導(dǎo)致花柱從3~4時(shí)期開始,由近軸側(cè)向遠(yuǎn)軸側(cè)運(yùn)動(dòng),最終由彎曲形態(tài)變豎直。(3)獲得了陽春砂花絲、花柱的轉(zhuǎn)錄組信息由于現(xiàn)今在NCBI中未有陽春砂的參考基因組或轉(zhuǎn)錄組序列,若想利用表達(dá)譜測(cè)序的方法研究花絲、花柱在彎曲運(yùn)動(dòng)前后基因表達(dá)量的變化,則必須構(gòu)建一個(gè)總樣品的轉(zhuǎn)錄本作為參考序列。因此我們提取1~7時(shí)期花絲、花柱的總RNA,然后等量混合,通過質(zhì)檢后利用Illumina測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序,獲得花絲、花柱總的轉(zhuǎn)錄組信息。共獲得94584個(gè)unigenes,其中共有62174個(gè)unigenes被注釋,注釋率為65.73%。有1656個(gè)unigenes注釋到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中注釋到生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有329個(gè);注釋到赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有438個(gè);注釋到細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有245個(gè);注釋到脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有168個(gè);注釋到油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有191個(gè);注釋到茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有176個(gè);注釋到水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有74個(gè);注釋到乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有139個(gè)。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,有42個(gè)unigenes注釋到生長(zhǎng)素生物合成酶基因;有50個(gè)unigenes注釋到赤霉素生物合成酶基因;有45個(gè)unigenes注釋到細(xì)胞分裂素生物合成酶基因;共有13個(gè)unigenes注釋到茉莉酸生物合成酶基因;有18個(gè)unigenes注釋到油菜素內(nèi)酯生物合成酶基因;有29個(gè)unigenes注釋到脫落酸生物合成酶基因;有24個(gè)unigenes注釋到水楊酸生物合成酶基因;共有23個(gè)unigenes注釋到乙烯生物合成酶基因。(4)獲得了不同生長(zhǎng)時(shí)期花絲、花柱的表達(dá)譜,篩選出了可能調(diào)控花絲、花柱運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵基因以獲得的陽春砂花絲、花柱的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列,對(duì)不同時(shí)期花絲、花柱分別單獨(dú)進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序分析。提取1~7時(shí)期花絲、花柱的總RNA,通過質(zhì)檢后采用BGI-Seq500測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)期花絲、花柱的基因表達(dá)譜,關(guān)注1~7時(shí)期花絲、花柱激素合成酶以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵因子基因表達(dá)量的變化,并且篩選出了大量可能調(diào)控花絲、花柱彎曲運(yùn)動(dòng)的差異表達(dá)的基因。第3~4時(shí)期是花絲、花柱運(yùn)動(dòng)發(fā)生的起始時(shí)間。3~4時(shí)期,花絲中AUX1基因上調(diào)表達(dá),GA_(20)ox、GA_3ox、TCH4、CYCD3基因下調(diào)表達(dá);花柱中AUX1、CKX、B-ARR、GA_2ox、PIF4、CYP85A2、BKI1基因上調(diào)表達(dá),TAA1、CPS、GA_3ox、GID2基因下調(diào)表達(dá)。這些差異表達(dá)的基因可能是調(diào)控花絲、花柱運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵基因。通過對(duì)相同時(shí)期花絲、花柱差異表達(dá)基因富集性分析發(fā)現(xiàn),相同時(shí)期在花絲與花柱激素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中共有差異表達(dá)的基因有AUX1、GH3、ARF、AUX/IAA、SAUR、B-ARR、KS、KO、KAO、GA_3ox、GA_2ox、PIF3、GID2、AOC、AOS、JAR1、JAZ、CYP85A2、CYCD3、BRI1、BKI1、TCH4、BAK1、AO、ZEP、NCED、NPR1、PR-1、ACS、ACO、SIMKK,且除了KS基因外,相同時(shí)期,相同基因在花絲和花柱中差異表達(dá)完全趨勢(shì)均相同,因此說明這些差異表達(dá)的基因?qū)ńz和花柱的運(yùn)動(dòng)有著重要的調(diào)控作用,并且這種調(diào)控是同步的。利用RT-PCR法對(duì)花絲、花柱中3個(gè)赤霉素生物合成酶基因和2個(gè)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)花絲、花柱GA_3ox、GA_(20)ox、GA_2ox等基因的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù)中對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致,并且呈顯著正相關(guān),說明表達(dá)譜測(cè)序的數(shù)據(jù)是真實(shí)可靠的。(5)分析了陽春砂花絲、花柱在生長(zhǎng)發(fā)育過程中部分激素生物合成酶基因表達(dá)量與相應(yīng)激素含量的相關(guān)性將不同生長(zhǎng)時(shí)期的花絲、花柱中生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸生物合成酶基因的表達(dá)量以及與花絲、花柱遠(yuǎn)近軸側(cè)IAA、CTK、GA_3、ABA的相對(duì)含量做相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)相同的酶基因在花絲與花柱中的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān),說明花絲與花柱的運(yùn)動(dòng)之間有著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。激素生物合成酶基因的表達(dá)量與花絲、花柱遠(yuǎn)近軸側(cè)激素的相對(duì)含量部分呈現(xiàn)正相關(guān),說明在花絲、花柱的生長(zhǎng)發(fā)育過程中,激素合成酶基因的表達(dá)與相應(yīng)激素的含量存在一定的相關(guān)性�？偨Y(jié)以上研究結(jié)果,陽春砂花絲、花柱運(yùn)動(dòng)的起始時(shí)間均為3~4時(shí)期,花絲運(yùn)動(dòng)的起始部位是部位4和部位5,并且由形態(tài)學(xué)上端向形態(tài)學(xué)下端延伸;花柱運(yùn)動(dòng)的部位主要集中在形態(tài)學(xué)上端的部位4和部位5。陽春砂花絲在3~4時(shí)期發(fā)生彎曲運(yùn)動(dòng)的機(jī)制可能是:GA_3含量的上升,AUX1基因的上調(diào)表達(dá),兩者共同促進(jìn)了花絲近軸側(cè)的生長(zhǎng);GA_3ox、GA_(20)ox的下調(diào)表達(dá),使遠(yuǎn)軸側(cè)GA_3含量下降,同時(shí)IAA和CTK的含量也下降,三者共同抑制了花絲遠(yuǎn)軸側(cè)的生長(zhǎng),最終導(dǎo)致花絲近軸側(cè)生長(zhǎng)速率超過遠(yuǎn)軸側(cè),并由近軸側(cè)向遠(yuǎn)軸側(cè)彎曲運(yùn)動(dòng)。陽春砂花柱在3~4時(shí)期發(fā)生彎曲運(yùn)動(dòng)的機(jī)制可能是:GA_2ox基因上調(diào)表達(dá),GA_3ox、GA_(20)ox基因下調(diào)表達(dá)使花柱近軸側(cè)GA_3含量下降,高濃度的GA_3對(duì)近軸側(cè)生長(zhǎng)抑制解除,同時(shí)CTK、IAA含量上升,B-ARR、AUX1基因上調(diào)表達(dá),促進(jìn)了花柱近軸側(cè)的生長(zhǎng);而GA_3含量的上升,PIF4基因上調(diào)表達(dá),ABA含量的上升,三者共同抑制了花柱遠(yuǎn)軸側(cè)的生長(zhǎng),最終導(dǎo)致花柱由近軸側(cè)向遠(yuǎn)軸側(cè)運(yùn)動(dòng),最終變直。
【圖文】：

1-1 體視鏡下觀察到的假合蕊柱形成前后的形態(tài)（陳紅，201：假合蕊柱形成前；B、D：假合蕊柱形成后； A、B：橫切面；C、紅色實(shí)線箭頭指示的是花柱，藍(lán)色虛線箭頭指示的是花藥圖 1-2 假合蕊柱形成前后的顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比（陳紅，2015）

圖 1-2 假合蕊柱形成前后的顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比（陳紅，2015）注：A：假合蕊柱形成前；B：假合蕊柱形成后紅色實(shí)線箭頭指示的是花柱，，藍(lán)色虛線箭頭指示的是花藥蕊運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.239

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2613815