【摘要】：陽春砂(Amomum villosum Lour.)來源于姜科豆蔻屬,是多年生常綠草本植物,以其干燥成熟的果實春砂仁入藥,是著名的“四大南藥”之一,具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效,為傳統(tǒng)的大宗常用中藥材,已有1300多年的應(yīng)用歷史。由于陽春砂特殊的花器官結(jié)構(gòu)——假合蕊柱,阻礙了蜜蜂等媒介為之授粉,導(dǎo)致陽春砂的自然結(jié)實率極低,僅為1.17%,嚴重的限制了春砂仁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。道地產(chǎn)區(qū)陽春市多采用人工授粉以提高產(chǎn)量,但人工授粉勞動強度高,而且即使通過人工授粉平均畝產(chǎn)仍不足5 kg,這抑制了農(nóng)戶種植的積極性。如果能人為改變陽春砂的花器官結(jié)構(gòu),使蜜蜂等蟲媒可以幫助授粉,提高自然授粉率,從而提高陽春砂的產(chǎn)量,將有利于擴大春砂仁的生產(chǎn),解決當前供不應(yīng)求的市場現(xiàn)狀,同時減少生產(chǎn)種植成本,提高農(nóng)民的收入。本課題組陳紅研究發(fā)現(xiàn),陽春砂的假合蕊柱結(jié)構(gòu)是在陽春砂小花生長發(fā)育過程中雌雄蕊的相對運動形成的。因此,本文在陳紅的研究基礎(chǔ)上進一步研究陽春砂花絲、花柱的運動機理,以期為改變陽春砂花器官結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ),為提高陽春砂自然授粉率提供理論根據(jù)。研究結(jié)果如下:(1)研究了陽春砂花絲、花柱運動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和運動發(fā)生的部位以及時間采用陳紅建立的陽春砂小花生長時期的劃分標準,按照長度從0.5 cm的小花開始,每伸長0.5 cm為一個時期,至開花后一天共劃分為0~7個不同的生長時期:第0時期、第1時期、第2時期、第3時期、第4時期、第5時期、第6時期、第7時期。第6時期為開花當天,第7時期為花后一天。通過制作不同生長時期的花絲、花柱的石蠟切片,測定了花絲和花柱在不同生長時期的細胞大小和分布。發(fā)現(xiàn)陽春砂花絲的運動是由于花絲遠近軸側(cè)細胞生長速率的不平衡導(dǎo)致的,并且這種運動是從花絲形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端依次發(fā)生的。0~3時期,花絲各部位遠軸側(cè)細胞基本均大于近軸側(cè),且超過近軸側(cè)3.52%~56.00%;到了第4時期和第5時期,花絲部位4、5近軸側(cè)的細胞比遠軸側(cè)大7.15%~29.84%;到了第6時期,花絲近軸側(cè)各部位的細胞大小均大于遠軸側(cè),且超過遠軸2.24%~21.38%,花絲已經(jīng)完全由近軸側(cè)向遠軸側(cè)彎曲。因此,花絲的彎曲運動是由于遠近軸側(cè)細胞增大的速率不平衡導(dǎo)致的,運動發(fā)生時間主要始于第3~4時期,運動發(fā)生的部位始于形態(tài)學(xué)上端的部位4和部位5,逐漸向形態(tài)學(xué)下端延伸。陽春砂花柱的運動是由于花柱遠近軸側(cè)細胞的分布以及生長速率的不平衡導(dǎo)致的�；ㄖh近軸側(cè)的結(jié)構(gòu)是不對稱的,近軸側(cè)比遠軸側(cè)多了4~6層較大的薄壁細胞。在小花生長發(fā)育的全過程中,同一部位近軸側(cè)細胞均顯著大于遠軸側(cè)。不同時期部位1、2、3遠近軸側(cè)細胞大小相差不大;部位4、5近軸側(cè)細胞比遠軸側(cè)細胞大25.36%~115.99%。小花在第3~4時期開始,部位5遠近軸側(cè)細胞迅速增大,近軸側(cè)細胞增大71.67%,遠軸側(cè)細胞增大25.04%;到了第5~6時期,部位4近軸側(cè)細胞迅速增大31.92%,遠軸側(cè)細胞增大18.33%,部位4、5近軸側(cè)細胞增大的速率均大于遠軸側(cè),導(dǎo)致花柱近軸側(cè)生長速率大于遠軸側(cè),并且由近軸側(cè)向遠軸側(cè)運動。因此,花柱由彎曲變直的過程也是起始于3~4時期,運動發(fā)生的部位主要在部位4和部位5。遠近軸側(cè)細胞形態(tài)的不對稱是其運動的基礎(chǔ),細胞生長速率的不平衡是其運動的根本原因。(2)研究了四種植物激素在花絲、花柱中的分布和相對含量通過免疫組化的方法測定了不同生長時期花絲、花柱中IAA、GA_3、CTK、ABA的相對含量和分布特性。3~4時期,花絲遠近軸側(cè)IAA含量均顯著下降,近軸側(cè)下降了52.05%,遠軸側(cè)下降了91.34%,遠軸側(cè)IAA含量下降的速率遠大于近軸側(cè),導(dǎo)致遠軸側(cè)細胞的生長速率小于近軸側(cè);遠軸側(cè)CTK含量下降37.14%,而近軸側(cè)CTK含量僅下降3.74%,遠軸側(cè)細胞分裂能力迅速減弱,花絲近軸側(cè)細胞分裂活躍,細胞數(shù)目增多;近軸側(cè)GA_3相對含量上升了12.02%,而遠軸側(cè)GA_3含量下降了7.05%,使近軸側(cè)細胞生長速率大于遠軸側(cè)。因此,可能是IAA、CTK、GA_3三者的共同作用,促進了近軸側(cè)細胞體積的增大和細胞數(shù)目的增多,最終導(dǎo)致花絲從3~4時期開始,由近軸側(cè)向遠軸側(cè)彎曲運動。1~3時期,花柱遠軸側(cè)高濃度IAA、GA_3、ABA抑制了細胞體積的增大,導(dǎo)致遠軸側(cè)細胞均小于近軸側(cè);但花柱遠軸側(cè)高濃度的IAA和GA_3協(xié)同高濃度的CTK促進了遠軸側(cè)細胞分裂,使遠軸側(cè)細胞數(shù)目增多且超過近軸側(cè),花柱呈現(xiàn)由遠軸側(cè)向近軸側(cè)彎曲的形態(tài)。3~4時期開始,花柱近軸側(cè)IAA、GA_3和ABA下降到適宜的濃度,對近軸側(cè)細胞生長的抑制作用解除,而遠軸側(cè)IAA和GA_3持續(xù)上升了21.61%和33.21%,對遠軸側(cè)細胞生長的抑制增強;近軸側(cè)CTK含量升高12.86%,且顯著高于遠軸側(cè),使近軸側(cè)細胞分裂比遠軸側(cè)活躍,細胞數(shù)目迅速增多;因此,可能是IAA、CTK、GA_3、ABA四者的共同作用,促進花柱近軸側(cè)細胞體積增大和數(shù)目增多,使花柱近軸側(cè)快速伸長,導(dǎo)致花柱從3~4時期開始,由近軸側(cè)向遠軸側(cè)運動,最終由彎曲形態(tài)變豎直。(3)獲得了陽春砂花絲、花柱的轉(zhuǎn)錄組信息由于現(xiàn)今在NCBI中未有陽春砂的參考基因組或轉(zhuǎn)錄組序列,若想利用表達譜測序的方法研究花絲、花柱在彎曲運動前后基因表達量的變化,則必須構(gòu)建一個總樣品的轉(zhuǎn)錄本作為參考序列。因此我們提取1~7時期花絲、花柱的總RNA,然后等量混合,通過質(zhì)檢后利用Illumina測序技術(shù)進行測序,獲得花絲、花柱總的轉(zhuǎn)錄組信息。共獲得94584個unigenes,其中共有62174個unigenes被注釋,注釋率為65.73%。有1656個unigenes注釋到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中注釋到生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有329個;注釋到赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有438個;注釋到細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有245個;注釋到脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有168個;注釋到油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有191個;注釋到茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有176個;注釋到水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有74個;注釋到乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的unigenes有139個。進一步對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行挖掘,有42個unigenes注釋到生長素生物合成酶基因;有50個unigenes注釋到赤霉素生物合成酶基因;有45個unigenes注釋到細胞分裂素生物合成酶基因;共有13個unigenes注釋到茉莉酸生物合成酶基因;有18個unigenes注釋到油菜素內(nèi)酯生物合成酶基因;有29個unigenes注釋到脫落酸生物合成酶基因;有24個unigenes注釋到水楊酸生物合成酶基因;共有23個unigenes注釋到乙烯生物合成酶基因。(4)獲得了不同生長時期花絲、花柱的表達譜,篩選出了可能調(diào)控花絲、花柱運動的關(guān)鍵基因以獲得的陽春砂花絲、花柱的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列,對不同時期花絲、花柱分別單獨進行表達譜測序分析。提取1~7時期花絲、花柱的總RNA,通過質(zhì)檢后采用BGI-Seq500測定不同生長時期花絲、花柱的基因表達譜,關(guān)注1~7時期花絲、花柱激素合成酶以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵因子基因表達量的變化,并且篩選出了大量可能調(diào)控花絲、花柱彎曲運動的差異表達的基因。第3~4時期是花絲、花柱運動發(fā)生的起始時間。3~4時期,花絲中AUX1基因上調(diào)表達,GA_(20)ox、GA_3ox、TCH4、CYCD3基因下調(diào)表達;花柱中AUX1、CKX、B-ARR、GA_2ox、PIF4、CYP85A2、BKI1基因上調(diào)表達,TAA1、CPS、GA_3ox、GID2基因下調(diào)表達。這些差異表達的基因可能是調(diào)控花絲、花柱運動的關(guān)鍵基因。通過對相同時期花絲、花柱差異表達基因富集性分析發(fā)現(xiàn),相同時期在花絲與花柱激素生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中共有差異表達的基因有AUX1、GH3、ARF、AUX/IAA、SAUR、B-ARR、KS、KO、KAO、GA_3ox、GA_2ox、PIF3、GID2、AOC、AOS、JAR1、JAZ、CYP85A2、CYCD3、BRI1、BKI1、TCH4、BAK1、AO、ZEP、NCED、NPR1、PR-1、ACS、ACO、SIMKK,且除了KS基因外,相同時期,相同基因在花絲和花柱中差異表達完全趨勢均相同,因此說明這些差異表達的基因?qū)ńz和花柱的運動有著重要的調(diào)控作用,并且這種調(diào)控是同步的。利用RT-PCR法對花絲、花柱中3個赤霉素生物合成酶基因和2個赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的相對表達量進行了分析,發(fā)現(xiàn)花絲、花柱GA_3ox、GA_(20)ox、GA_2ox等基因的相對表達量的變化趨勢與表達譜測序數(shù)據(jù)中對應(yīng)基因表達量的變化趨勢一致,并且呈顯著正相關(guān),說明表達譜測序的數(shù)據(jù)是真實可靠的。(5)分析了陽春砂花絲、花柱在生長發(fā)育過程中部分激素生物合成酶基因表達量與相應(yīng)激素含量的相關(guān)性將不同生長時期的花絲、花柱中生長素、細胞分裂素、赤霉素和脫落酸生物合成酶基因的表達量以及與花絲、花柱遠近軸側(cè)IAA、CTK、GA_3、ABA的相對含量做相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)相同的酶基因在花絲與花柱中的表達量呈極顯著正相關(guān),說明花絲與花柱的運動之間有著較強的關(guān)聯(lián)性。激素生物合成酶基因的表達量與花絲、花柱遠近軸側(cè)激素的相對含量部分呈現(xiàn)正相關(guān),說明在花絲、花柱的生長發(fā)育過程中,激素合成酶基因的表達與相應(yīng)激素的含量存在一定的相關(guān)性。總結(jié)以上研究結(jié)果,陽春砂花絲、花柱運動的起始時間均為3~4時期,花絲運動的起始部位是部位4和部位5,并且由形態(tài)學(xué)上端向形態(tài)學(xué)下端延伸;花柱運動的部位主要集中在形態(tài)學(xué)上端的部位4和部位5。陽春砂花絲在3~4時期發(fā)生彎曲運動的機制可能是:GA_3含量的上升,AUX1基因的上調(diào)表達,兩者共同促進了花絲近軸側(cè)的生長;GA_3ox、GA_(20)ox的下調(diào)表達,使遠軸側(cè)GA_3含量下降,同時IAA和CTK的含量也下降,三者共同抑制了花絲遠軸側(cè)的生長,最終導(dǎo)致花絲近軸側(cè)生長速率超過遠軸側(cè),并由近軸側(cè)向遠軸側(cè)彎曲運動。陽春砂花柱在3~4時期發(fā)生彎曲運動的機制可能是:GA_2ox基因上調(diào)表達,GA_3ox、GA_(20)ox基因下調(diào)表達使花柱近軸側(cè)GA_3含量下降,高濃度的GA_3對近軸側(cè)生長抑制解除,同時CTK、IAA含量上升,B-ARR、AUX1基因上調(diào)表達,促進了花柱近軸側(cè)的生長;而GA_3含量的上升,PIF4基因上調(diào)表達,ABA含量的上升,三者共同抑制了花柱遠軸側(cè)的生長,最終導(dǎo)致花柱由近軸側(cè)向遠軸側(cè)運動,最終變直。
【圖文】：

1-1 體視鏡下觀察到的假合蕊柱形成前后的形態(tài)（陳紅，201：假合蕊柱形成前；B、D：假合蕊柱形成后； A、B：橫切面；C、紅色實線箭頭指示的是花柱，藍色虛線箭頭指示的是花藥圖 1-2 假合蕊柱形成前后的顯微結(jié)構(gòu)對比（陳紅，2015）

圖 1-2 假合蕊柱形成前后的顯微結(jié)構(gòu)對比（陳紅，2015）注：A：假合蕊柱形成前；B：假合蕊柱形成后紅色實線箭頭指示的是花柱，，藍色虛線箭頭指示的是花藥蕊運動現(xiàn)象
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239

【參考文獻】

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本文編號：2613815