丹參轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH74調(diào)控丹參酮生物合成的分子機(jī)制
發(fā)布時(shí)間：2020-03-31 07:24
【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我國傳統(tǒng)藥材,在預(yù)防和治療心腦血管疾病等方面療效顯著使得丹參藥材緊缺,市場上供不應(yīng)求。丹參的藥效成分主要是丹參酮類和丹酚酸類化合物,解析其活性成分的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對提升丹參藥材品質(zhì)具有重要的理論指導(dǎo)意義。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物次生代謝方面扮演著重要角色,本研究以丹參為試驗(yàn)材料,重點(diǎn)分析了一個在根部高豐度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH74調(diào)控丹參酮生物合成的功能,丹參毛狀根中過量表達(dá)SmbHLH74可以顯著抑制丹參酮的積累,利用凝膠遷移阻滯、染色質(zhì)免疫共沉淀以及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測等試驗(yàn),解析了轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH74抑制丹參酮生物合成的分子機(jī)制;另外發(fā)現(xiàn)SmMYC2是SmbHLH74的直接上游調(diào)控分子,進(jìn)而探討了JA通過SmMYC2削弱SmbHLH74抑制丹參酮積累的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.從丹參中克隆了SmbHLH74基因,CDS為696 bp,編碼231個氨基酸。2.SmbHLH74在根中高水平表達(dá),莖和葉片中的表達(dá)水平很低;外源MeJA處理可以顯著抑制SmbHLH74的轉(zhuǎn)錄。3.通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得過表達(dá)SmbHLH74的丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根,在SmbHLH74-OE4、SmbHLH74-OE12和SmbHLH74-OE19過表達(dá)毛狀根株系中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量顯著降低;利用RT-qPCR分析了轉(zhuǎn)基因材料中丹參酮生物合成途徑基因的表達(dá)水平,SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的表達(dá)量呈顯著下調(diào),推測這三個基因可能是SmbHLH74的直接靶基因。4.為解析SmbHLH74抑制丹參酮積累的分子機(jī)制,利用ChIP-qPCR和EMSA試驗(yàn)證實(shí)了SmbHLH74轉(zhuǎn)錄因子在丹參體內(nèi)和體外直接結(jié)合SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的啟動子;進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試驗(yàn)表明SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。5.JA顯著抑制SmbHLH74的轉(zhuǎn)錄,推測JA信號關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2可能是SmbHLH74的上游分子,通過Y1H和EMSA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SmMYC2可以結(jié)合SmbHLH74的啟動子;GUS報(bào)告試驗(yàn)表明SmMYC2直接負(fù)調(diào)控SmbHLH74的轉(zhuǎn)錄,說明SmMYC2直接介導(dǎo)了JA對SmbHLH74的轉(zhuǎn)錄抑制。綜上,本研究揭示了SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的轉(zhuǎn)錄從而負(fù)調(diào)控丹參酮生物合成,而JA通過SmMYC2直接抑制SmbHLH74的轉(zhuǎn)錄,削弱了SmbHLH74對丹參酮積累的抑制。
【圖文】：
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文ang et al., 2012a；蔡媛 等, 2013)。前，丹參酮生物合成途徑的解析基本完成，已經(jīng)有不少關(guān)鍵酶基因被成功克了功能驗(yàn)證(宋經(jīng)元 等, 2013；Ma et al., 2015)，包括 SmHMGR1、SmDXS、SmHPS、SmCPS、SmKSL 和 SmCYP76AH1 等。其中 Kai et al.利用基因工程手段表達(dá) SmHMGR1 和 SmGGPPS，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮含量顯著升高， 4.74 倍(Kai et al., 2011)。Hao et al.發(fā)現(xiàn) SmHDR1 促進(jìn)丹參毛狀根中丹參酮的 et al., 2013)。Zhou et al.研究表明，SmCPS 和 SmKSL 是丹參酮合成途徑中的因(Zhou et al., 2012)。Guo et al.利用酵母系統(tǒng)，證明 SmCYP76AH1 能有效催酮二烯生成鐵銹醇，產(chǎn)量高達(dá) 10.5 mg/L(Guo et al., 2013；蔡媛 等, 2013)。由以丹參酮生物合成途徑中的酶基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用基因工程手段可以有效提高含量(Nims et al., 2006)。
圖 2 凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The PCR products detection by agarose gel electrophoresis蛋白結(jié)構(gòu)分析，該基因編碼 231 個氨基酸，NCBI 分析如圖 3 所示，，SmbHLH74轉(zhuǎn)錄因子有保守的 HLH 結(jié)構(gòu)域，有特定的 E-box/N-box 結(jié)合位點(diǎn)，屬于 bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子。SOPMA 預(yù)測，該轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核。如圖 4 所示把 SmbHLH74 與擬南芥的 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn) SmbHLH74 與 AtbHLH75 的同源性最高。ExPASy 分析如圖 5 所示，SmbHLH74 蛋白的分子量約為 26.3 KD，理論 pI 為 5.84，為親水性蛋白。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.53
【圖文】：
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文ang et al., 2012a；蔡媛 等, 2013)。前，丹參酮生物合成途徑的解析基本完成，已經(jīng)有不少關(guān)鍵酶基因被成功克了功能驗(yàn)證(宋經(jīng)元 等, 2013；Ma et al., 2015)，包括 SmHMGR1、SmDXS、SmHPS、SmCPS、SmKSL 和 SmCYP76AH1 等。其中 Kai et al.利用基因工程手段表達(dá) SmHMGR1 和 SmGGPPS，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮含量顯著升高， 4.74 倍(Kai et al., 2011)。Hao et al.發(fā)現(xiàn) SmHDR1 促進(jìn)丹參毛狀根中丹參酮的 et al., 2013)。Zhou et al.研究表明，SmCPS 和 SmKSL 是丹參酮合成途徑中的因(Zhou et al., 2012)。Guo et al.利用酵母系統(tǒng)，證明 SmCYP76AH1 能有效催酮二烯生成鐵銹醇，產(chǎn)量高達(dá) 10.5 mg/L(Guo et al., 2013；蔡媛 等, 2013)。由以丹參酮生物合成途徑中的酶基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用基因工程手段可以有效提高含量(Nims et al., 2006)。
圖 2 凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物Fig.2 The PCR products detection by agarose gel electrophoresis蛋白結(jié)構(gòu)分析，該基因編碼 231 個氨基酸，NCBI 分析如圖 3 所示，，SmbHLH74轉(zhuǎn)錄因子有保守的 HLH 結(jié)構(gòu)域，有特定的 E-box/N-box 結(jié)合位點(diǎn)，屬于 bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子。SOPMA 預(yù)測，該轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核。如圖 4 所示把 SmbHLH74 與擬南芥的 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn) SmbHLH74 與 AtbHLH75 的同源性最高。ExPASy 分析如圖 5 所示，SmbHLH74 蛋白的分子量約為 26.3 KD，理論 pI 為 5.84，為親水性蛋白。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.53
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1 黃為鈞,談夫,羅厚蔚;丹參酮同系物的熱力學(xué)研究[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào);1988年02期
2 簡洋輝,徐國鈞,金蓉鸞,徐珞珊;中藥丹參類的質(zhì)量研究[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào);1989年01期
3 李s
本文編號：2608760
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