發(fā)布時間：2020-03-31 07:24

【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我國傳統(tǒng)藥材,在預防和治療心腦血管疾病等方面療效顯著使得丹參藥材緊缺,市場上供不應求。丹參的藥效成分主要是丹參酮類和丹酚酸類化合物,解析其活性成分的代謝調控網絡,對提升丹參藥材品質具有重要的理論指導意義。轉錄因子在調控植物次生代謝方面扮演著重要角色,本研究以丹參為試驗材料,重點分析了一個在根部高豐度表達的轉錄因子SmbHLH74調控丹參酮生物合成的功能,丹參毛狀根中過量表達SmbHLH74可以顯著抑制丹參酮的積累,利用凝膠遷移阻滯、染色質免疫共沉淀以及雙熒光素酶報告基因檢測等試驗,解析了轉錄因子SmbHLH74抑制丹參酮生物合成的分子機制;另外發(fā)現SmMYC2是SmbHLH74的直接上游調控分子,進而探討了JA通過SmMYC2削弱SmbHLH74抑制丹參酮積累的分子機制。主要結果如下:1.從丹參中克隆了SmbHLH74基因,CDS為696 bp,編碼231個氨基酸。2.SmbHLH74在根中高水平表達,莖和葉片中的表達水平很低;外源MeJA處理可以顯著抑制SmbHLH74的轉錄。3.通過遺傳轉化獲得過表達SmbHLH74的丹參轉基因毛狀根,在SmbHLH74-OE4、SmbHLH74-OE12和SmbHLH74-OE19過表達毛狀根株系中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量顯著降低;利用RT-qPCR分析了轉基因材料中丹參酮生物合成途徑基因的表達水平,SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的表達量呈顯著下調,推測這三個基因可能是SmbHLH74的直接靶基因。4.為解析SmbHLH74抑制丹參酮積累的分子機制,利用ChIP-qPCR和EMSA試驗證實了SmbHLH74轉錄因子在丹參體內和體外直接結合SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的啟動子;進一步雙熒光素酶報告基因檢測試驗表明SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1啟動子的轉錄活性。5.JA顯著抑制SmbHLH74的轉錄,推測JA信號關鍵轉錄因子SmMYC2可能是SmbHLH74的上游分子,通過Y1H和EMSA試驗發(fā)現SmMYC2可以結合SmbHLH74的啟動子;GUS報告試驗表明SmMYC2直接負調控SmbHLH74的轉錄,說明SmMYC2直接介導了JA對SmbHLH74的轉錄抑制。綜上,本研究揭示了SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的轉錄從而負調控丹參酮生物合成,而JA通過SmMYC2直接抑制SmbHLH74的轉錄,削弱了SmbHLH74對丹參酮積累的抑制。
【圖文】：

沈陽農業(yè)大學碩士學位論文ang et al., 2012a；蔡媛 等, 2013)。前，丹參酮生物合成途徑的解析基本完成，已經有不少關鍵酶基因被成功克了功能驗證(宋經元 等, 2013；Ma et al., 2015)，包括 SmHMGR1、SmDXS、SmHPS、SmCPS、SmKSL 和 SmCYP76AH1 等。其中 Kai et al.利用基因工程手段表達 SmHMGR1 和 SmGGPPS，發(fā)現轉基因毛狀根中丹參酮含量顯著升高， 4.74 倍(Kai et al., 2011)。Hao et al.發(fā)現 SmHDR1 促進丹參毛狀根中丹參酮的 et al., 2013)。Zhou et al.研究表明，SmCPS 和 SmKSL 是丹參酮合成途徑中的因(Zhou et al., 2012)。Guo et al.利用酵母系統(tǒng)，證明 SmCYP76AH1 能有效催酮二烯生成鐵銹醇，產量高達 10.5 mg/L(Guo et al., 2013；蔡媛 等, 2013)。由以丹參酮生物合成途徑中的酶基因為靶點，利用基因工程手段可以有效提高含量(Nims et al., 2006)。

圖 2 凝膠電泳檢測 PCR 產物Fig.2 The PCR products detection by agarose gel electrophoresis蛋白結構分析，該基因編碼 231 個氨基酸，NCBI 分析如圖 3 所示，，SmbHLH74轉錄因子有保守的 HLH 結構域，有特定的 E-box/N-box 結合位點，屬于 bHLH 家族轉錄因子。SOPMA 預測，該轉錄因子定位于細胞核。如圖 4 所示把 SmbHLH74 與擬南芥的 bHLH 轉錄因子構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現 SmbHLH74 與 AtbHLH75 的同源性最高。ExPASy 分析如圖 5 所示，SmbHLH74 蛋白的分子量約為 26.3 KD，理論 pI 為 5.84，為親水性蛋白。
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.53

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1 黃為鈞,談夫,羅厚蔚;丹參酮同系物的熱力學研究[J];中國藥科大學學報;1988年02期

2 簡洋輝,徐國鈞,金蓉鸞,徐珞珊;中藥丹參類的質量研究[J];中國藥科大學學報;1989年01期

3 李s

本文編號：2608760