【摘要】：選擇性剪接是真核生物基因表達(dá)的一種重要調(diào)控機(jī)制。同一個(gè)前體mRNA(pre-mRNA)經(jīng)過(guò)選擇性剪接可以形成多種不同的成熟mRNA,從而翻譯出很多具有不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白,也是產(chǎn)生蛋白多樣性的主要方式。真核生物的剪接因子是選擇性剪接的參與者和直接調(diào)控元件。作為最重要的兩類基本剪接因子之一,SR蛋白家族,具有一個(gè)富含絲氨酸/精氨酸(S/R)重復(fù)序列的RS結(jié)構(gòu)域,在RNA剪接體的組裝和選擇性剪接的調(diào)控過(guò)程中具有重要的作用。近年來(lái),關(guān)于植物中SR蛋白家族的研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展,但多限于擬南芥和水稻等模式植物中,而對(duì)木薯這一重要經(jīng)濟(jì)作物的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究以木薯為研究材料,基于已完成測(cè)序的木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù),利用Blast等程序鑒定到18個(gè)可編碼木薯SR蛋白的基因,通過(guò)MEGA程序構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹且進(jìn)行了系統(tǒng)命名,并對(duì)木薯SR蛋白的部分生物學(xué)功能進(jìn)行了初探,具體研究結(jié)果如下:首先,通過(guò)氨基酸序列多重比對(duì),按照植物SR蛋白的結(jié)構(gòu)特性和同源性,將所鑒定到的18個(gè)木薯SR蛋白歸入SR蛋白的六大亞家族,并進(jìn)行了蛋白理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明,由于富含帶正電荷的Arg殘基,SR蛋白均為親水的堿性蛋白。對(duì)基因結(jié)構(gòu)的分析可知,同一亞家族的成員在外顯子/內(nèi)含子數(shù)目上具有一定的保守性,而外顯子和內(nèi)含子長(zhǎng)度不同。對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)包含的順式作用元件的分析預(yù)測(cè)表明,其特異性元件主要包括光應(yīng)答元件、各種激素應(yīng)答元件、脅迫應(yīng)答元件等,初步映證了木薯SR蛋白與逆境脅迫關(guān)系密切。其次,提取了木薯不同組織和脅迫處理下的RNA樣本,通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR對(duì)其剪接方式和表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)18個(gè)木薯SR基因中有14個(gè)(78%)表現(xiàn)出組織特異性的選擇性剪接。此外,逆境脅迫處理增加了基因的不同剪接方式,且部分SR蛋白的基因表達(dá)和剪接模式受到一種或多種脅迫的影響,這與擬南芥中的相關(guān)結(jié)果相一致。另外,ABA處理后大部分木薯SR蛋白都出現(xiàn)不同的剪接模式,而擬南芥中只有三個(gè)基因出現(xiàn)剪接差異。最后,為進(jìn)一步研究木薯SR蛋白的生物學(xué)功能,以木薯不同組織部位和不同逆境處理的RNA為材料,利用Gateway BP克隆酶將18個(gè)木薯SR蛋白轉(zhuǎn)入到pDONR207入門載體中,并通過(guò)Gateway LR克隆酶轉(zhuǎn)入到含有在N或C末端的GFP蛋白標(biāo)簽的載體中。通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)GFP融合蛋白,研究發(fā)現(xiàn)木薯18蛋白都具有位于細(xì)胞核中的熒光信號(hào),表明木薯SR蛋白是核定位蛋白,這與SR蛋白作為重要剪接因子參與和調(diào)控轉(zhuǎn)錄后剪接的生理功能相一致。
【圖文】：

木薯ＳＲ蛋白家族的系統(tǒng)命名及表達(dá)分析是蛋白結(jié)構(gòu)和功能多樣性的增加。同一邋ｐｒｅ－ｍＲＮＡ經(jīng)過(guò)選擇性剪接產(chǎn)體，這些剪接變體具有不同的核苷酸數(shù)目和序列，相應(yīng)地被翻譯成具基數(shù)目和序列的多肽鏈，從而折疊成擁有不同二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域白在生物活性、穩(wěn)定性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、定位和功能等方面也各不相同。有保守或可變結(jié)構(gòu)域的蛋白家族的一種重要機(jī)制，并可能代表一種在非常重要的模型（Ａｎｄｒｅａｄｉｓｅｔａｌ．，１９８７）。逡逑是對(duì)轉(zhuǎn)錄后ｍＲＮＡ命運(yùn)的影響，包括改變ｍＲＮＡ的穩(wěn)定性和無(wú)邋衰變（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｄｅｃａｙ，邋ＮＭＤ）邋（Ｋａｌｙｎａｅｔａｌ．，，２０１２）。改的選擇性剪接主要發(fā)生在５’或３’邋ＵＴＲ邋（非編碼區(qū)），這些區(qū)域與ｍ衰期密切相關(guān)。ＮＭＤ是一種監(jiān)督機(jī)制，它選擇性地降解由于移碼或終止翻譯的ｍＲＮＡ邋（劉靜等，２０１５）；當(dāng)ＩＲ序列中保留的內(nèi)含子含，該ｍＲＮＡ常經(jīng)由無(wú)義介導(dǎo)衰變而降解。這一過(guò)程間接對(duì)相應(yīng)基因控。逡逑邐邋一邋？，‘一？？邋產(chǎn)、邐逡逑￣￣

圖１．２植物ＳＲ蛋白亞家族結(jié)構(gòu)域（Ｂａｒｔａｅｔａｌ．，邋２０１０）逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｄｏｍａｉｎ邋ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ＳＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ邋（Ｂａｒｔａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０）逡逑ＳＲ蛋白主要行使剪接調(diào)控功能，在外顯子決定的復(fù)合體中，ＳＲ蛋白特異性結(jié)合逡逑ＥＳＥ，通過(guò)Ｕ２ＡＦ邋（Ｕ２ｓｎＲＮＰ的輔因子）結(jié)合激活上游弱的３’剪接位點(diǎn)；或通過(guò)逡逑ＵｌｓｎＲＮＰ結(jié)合激活弱的５’剪接位點(diǎn)（Ｇｒａｖｅｌｅｙ，２０００）。如果一段ｐｒｅ－ｍＲＮＡ中內(nèi)逡逑含子有２個(gè)以上，那么高濃度的ＳＲ蛋白傾向于選擇最近的５’邋ＳＳ，而不會(huì)激活較遠(yuǎn)逡逑的５’邋ＳＳ，這種近端效應(yīng)可能在選擇性剪接的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。此外，ＳＲ蛋白逡逑還在多種代謝途徑中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，包括ｍＲＮＡ輸出、ＤＮＡ和ＲＮＡ穩(wěn)定性、逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ加工、ｍＲＮＡ質(zhì)量控制、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控等。除ＳＣ３５因其自身存在核滯逡逑留信號(hào)只在細(xì)胞核中出現(xiàn)外，其它ＳＲ蛋白都是核質(zhì)穿梭蛋白，這種定位差異暗示了逡逑它們可能執(zhí)行不同的功能。細(xì)胞核中ＳＲ蛋白的分布并不均勻；它們大多富集在核散逡逑斑（ｎｕｃｌｅａｒ邋ｓｐｅｃｋｌｅｓ）區(qū)域，家族成員間的分布情況十分相似（Ｓｉｎｇｅｒ邋ｅｔａｌ．，１９９７）。逡逑通常認(rèn)為，核散斑是核內(nèi)剪接因子的儲(chǔ)存庫(kù)；該區(qū)域與細(xì)胞內(nèi)的活性基因相互作用，逡逑使轉(zhuǎn)錄與剪接更加有效地相藕聯(lián)（Ｍｉｓｔｅｌｉｅｔａｌ．，１９９９），為基因快速有效表達(dá)提供了逡逑良好的時(shí)空環(huán)境。逡逑
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S533

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2607540