【摘要】：選擇性剪接是真核生物基因表達的一種重要調控機制。同一個前體mRNA(pre-mRNA)經(jīng)過選擇性剪接可以形成多種不同的成熟mRNA,從而翻譯出很多具有不同結構和功能的蛋白,也是產生蛋白多樣性的主要方式。真核生物的剪接因子是選擇性剪接的參與者和直接調控元件。作為最重要的兩類基本剪接因子之一,SR蛋白家族,具有一個富含絲氨酸/精氨酸(S/R)重復序列的RS結構域,在RNA剪接體的組裝和選擇性剪接的調控過程中具有重要的作用。近年來,關于植物中SR蛋白家族的研究已取得長足進展,但多限于擬南芥和水稻等模式植物中,而對木薯這一重要經(jīng)濟作物的相關研究未見報道。本研究以木薯為研究材料,基于已完成測序的木薯基因組數(shù)據(jù)庫,利用Blast等程序鑒定到18個可編碼木薯SR蛋白的基因,通過MEGA程序構建了系統(tǒng)發(fā)生樹且進行了系統(tǒng)命名,并對木薯SR蛋白的部分生物學功能進行了初探,具體研究結果如下:首先,通過氨基酸序列多重比對,按照植物SR蛋白的結構特性和同源性,將所鑒定到的18個木薯SR蛋白歸入SR蛋白的六大亞家族,并進行了蛋白理化性質分析。結果表明,由于富含帶正電荷的Arg殘基,SR蛋白均為親水的堿性蛋白。對基因結構的分析可知,同一亞家族的成員在外顯子/內含子數(shù)目上具有一定的保守性,而外顯子和內含子長度不同。對基因啟動子區(qū)包含的順式作用元件的分析預測表明,其特異性元件主要包括光應答元件、各種激素應答元件、脅迫應答元件等,初步映證了木薯SR蛋白與逆境脅迫關系密切。其次,提取了木薯不同組織和脅迫處理下的RNA樣本,通過RT-PCR和qRT-PCR對其剪接方式和表達模式進行分析,發(fā)現(xiàn)18個木薯SR基因中有14個(78%)表現(xiàn)出組織特異性的選擇性剪接。此外,逆境脅迫處理增加了基因的不同剪接方式,且部分SR蛋白的基因表達和剪接模式受到一種或多種脅迫的影響,這與擬南芥中的相關結果相一致。另外,ABA處理后大部分木薯SR蛋白都出現(xiàn)不同的剪接模式,而擬南芥中只有三個基因出現(xiàn)剪接差異。最后,為進一步研究木薯SR蛋白的生物學功能,以木薯不同組織部位和不同逆境處理的RNA為材料,利用Gateway BP克隆酶將18個木薯SR蛋白轉入到pDONR207入門載體中,并通過Gateway LR克隆酶轉入到含有在N或C末端的GFP蛋白標簽的載體中。通過煙草瞬時表達系統(tǒng)表達GFP融合蛋白,研究發(fā)現(xiàn)木薯18蛋白都具有位于細胞核中的熒光信號,表明木薯SR蛋白是核定位蛋白,這與SR蛋白作為重要剪接因子參與和調控轉錄后剪接的生理功能相一致。
【圖文】：

木薯ＳＲ蛋白家族的系統(tǒng)命名及表達分析是蛋白結構和功能多樣性的增加。同一邋ｐｒｅ－ｍＲＮＡ經(jīng)過選擇性剪接產體，這些剪接變體具有不同的核苷酸數(shù)目和序列，相應地被翻譯成具基數(shù)目和序列的多肽鏈，從而折疊成擁有不同二、三級結構和結構域白在生物活性、穩(wěn)定性、信號轉導、定位和功能等方面也各不相同。有保守或可變結構域的蛋白家族的一種重要機制，并可能代表一種在非常重要的模型（Ａｎｄｒｅａｄｉｓｅｔａｌ．，１９８７）。逡逑是對轉錄后ｍＲＮＡ命運的影響，包括改變ｍＲＮＡ的穩(wěn)定性和無邋衰變（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｄｅｃａｙ，邋ＮＭＤ）邋（Ｋａｌｙｎａｅｔａｌ．，，２０１２）。改的選擇性剪接主要發(fā)生在５’或３’邋ＵＴＲ邋（非編碼區(qū)），這些區(qū)域與ｍ衰期密切相關。ＮＭＤ是一種監(jiān)督機制，它選擇性地降解由于移碼或終止翻譯的ｍＲＮＡ邋（劉靜等，２０１５）；當ＩＲ序列中保留的內含子含，該ｍＲＮＡ常經(jīng)由無義介導衰變而降解。這一過程間接對相應基因控。逡逑邐邋一邋？，‘一？？邋產、邐逡逑￣￣

圖１．２植物ＳＲ蛋白亞家族結構域（Ｂａｒｔａｅｔａｌ．，邋２０１０）逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｄｏｍａｉｎ邋ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｐｌａｎｔ邋ＳＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ邋（Ｂａｒｔａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０）逡逑ＳＲ蛋白主要行使剪接調控功能，在外顯子決定的復合體中，ＳＲ蛋白特異性結合逡逑ＥＳＥ，通過Ｕ２ＡＦ邋（Ｕ２ｓｎＲＮＰ的輔因子）結合激活上游弱的３’剪接位點；或通過逡逑ＵｌｓｎＲＮＰ結合激活弱的５’剪接位點（Ｇｒａｖｅｌｅｙ，２０００）。如果一段ｐｒｅ－ｍＲＮＡ中內逡逑含子有２個以上，那么高濃度的ＳＲ蛋白傾向于選擇最近的５’邋ＳＳ，而不會激活較遠逡逑的５’邋ＳＳ，這種近端效應可能在選擇性剪接的調控中發(fā)揮重要作用。此外，ＳＲ蛋白逡逑還在多種代謝途徑中發(fā)揮著重要調控作用，包括ｍＲＮＡ輸出、ＤＮＡ和ＲＮＡ穩(wěn)定性、逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ加工、ｍＲＮＡ質量控制、轉錄和翻譯調控等。除ＳＣ３５因其自身存在核滯逡逑留信號只在細胞核中出現(xiàn)外，其它ＳＲ蛋白都是核質穿梭蛋白，這種定位差異暗示了逡逑它們可能執(zhí)行不同的功能。細胞核中ＳＲ蛋白的分布并不均勻；它們大多富集在核散逡逑斑（ｎｕｃｌｅａｒ邋ｓｐｅｃｋｌｅｓ）區(qū)域，家族成員間的分布情況十分相似（Ｓｉｎｇｅｒ邋ｅｔａｌ．，１９９７）。逡逑通常認為，核散斑是核內剪接因子的儲存庫；該區(qū)域與細胞內的活性基因相互作用，逡逑使轉錄與剪接更加有效地相藕聯(lián)（Ｍｉｓｔｅｌｉｅｔａｌ．，１９９９），為基因快速有效表達提供了逡逑良好的時空環(huán)境。逡逑
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S533

【參考文獻】

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本文編號：2607540