木質(zhì)纖維素是自然界中分布最廣泛且含量最多的生物質(zhì)資源,作為植物細(xì)胞壁的主要組成部分,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,難以分解,利用自然界微生物產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素酶來分解木質(zhì)纖維素,這對解決環(huán)境污染,能源危機(jī),食品短缺和人類可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。木質(zhì)纖維素分解是堆肥過程中主要的生物化學(xué)反應(yīng),是由微生物分泌的木質(zhì)纖維酶通過水解作用來完成的,木質(zhì)纖維素酶活力的大小將直接影響堆肥效率的高低。選擇南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選的高效纖維素分解茵 A.fumigatus Z5,將其接種在以稻草秸稈作為唯一碳源的曼德爾培養(yǎng)基中,研究其對稻草的降解,結(jié)果顯示,稻草秸稈中的纖維素和半纖維素容易分解,木質(zhì)素較難分解。多糖單加氧酶(PMOs),又稱糖苷水解酶家族(GH61),在木質(zhì)纖維素分解過程中發(fā)揮了重要作用。本研究擬采用熒光定量PCR方法研究菌株A.fumigatus Z5中GH61家族基因在不同碳源代謝下的轉(zhuǎn)錄差異;通過構(gòu)建酵母X33表達(dá)載體,異源表達(dá)菌株Z5中多糖單加氧酶(PMOs)基因,經(jīng)親和層析純化獲得重組PMOs蛋白并研究其酶學(xué)特性;詳盡的闡明PMOs的功能,揭示催化木質(zhì)纖維素分解及與木質(zhì)纖維素酶協(xié)同作用提高催化效率的機(jī)制,為提高堆肥效率提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)選用的是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),它能進(jìn)行蛋白的加工,而且能夠進(jìn)行蛋白折疊,及翻譯等修飾作用。而且操作簡單、廉價(jià),且表達(dá)水平更高。外源蛋白表達(dá)水平很高。本試驗(yàn)以畢赤酵母X33作為表達(dá)宿主,設(shè)計(jì)特異性引物,以 A.fumigatus Z5 RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA分別擴(kuò)增多糖單加氧酶(PMOs)基因,并連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA上,最后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X33表達(dá)。結(jié)果表明,成功得到三種純化后的多糖單加氧酶(PMOs)蛋白。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S141.4
【部分圖文】：

除掉其中部分能被反芻動物較低效率利用外，大多數(shù)通過燃燒就地銷毀，這??很容易造成環(huán)境污染和能源浪費(fèi)，木質(zhì)纖維素主要是由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素??相互鉸接而成的（圖１－１）?［２，３］。纖維素是一種高聚合度化合物，由成千上萬個吡喃葡??萄糖通過Ｐ－１，４－糖苷鍵連接在一起形成的，其聚合度在很寬的范圍，它的分子式為??（Ｃ６Ｈ１Ｑ０５）?［４］，因而來說纖維素的分子量比較大，而且不溶于水及一般有機(jī)溶劑，在??常溫下，它是比較穩(wěn)定的，這是因?yàn)槔w維素分子之間存在氫鍵的緣故，纖維素在結(jié)構(gòu)??上又可以分為３層［４６１，第一層是單分子層，它是纖維素單分子層也是由葡萄糖組成的??高分子聚合物；第二層是超分子層，就是自組裝的纖維素晶體；第三層是原纖結(jié)構(gòu)層，??是由纖維素晶體與無定形的纖維素分子組成的基元原纖等然后再進(jìn)一步進(jìn)而組裝成??為更大的纖維結(jié)構(gòu)。一般來說大約一百個纖維素葡萄糖殘基聚合成結(jié)晶度為３－５?ｎｍ的??基元原纖，基元原纖再進(jìn)一步聚集成截面積為１２ｎｍｘｌ２ｎｍ的微原纖。同時微原纖內(nèi)??散布著半纖維素，在微原纖的外圍還包圍著后期合成的木質(zhì)素。纖維素微原纖再進(jìn)一??步聚集成更大的大原纖［４７］

堆肥菌株也冷／ｍ＇ｇａｔｏ?Ｚ５對稻草的降解及其多糖單加氧酶的異源表達(dá)研究單加氧酶的分類及其木質(zhì)纖維素分解增效作用??單加氧酶的分類??加氧酶（ＰＭＯｓ）又稱為ＧＨ６１家族水解酶，被認(rèn)為是糖苷水解員［３７］。大多數(shù)糖苷水解酶６１家族基因沒有水解活性，然而一些酶在二價(jià)金屬離子及還原劑存在時，可以顯著減少木質(zhì)纖維素水素酶量，不僅可以提高木質(zhì)纖維的分解速率，而且可以降低功能效應(yīng)的影響［７’３６Ｉ３８１。ＰＭＯｓ可分為ＰＭＯ－１和ＰＭＯ－２兩大類（圖ｌ－２）葡萄糖單體的Ｃ－１位置奪取氫原子后形成內(nèi)酯型糖，接著內(nèi)酯型酸，被磷酸化后又可以通過磷酸戊糖途徑被代謝；而ＰＭＯ－２則的Ｃ－４位奪取氫原子生產(chǎn)非還原端被氧化的醛酮糖［３９］。??－Ｉ￣￣〇ｒ

?不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致糖苷鍵的斷裂，相鄰的糖之間發(fā)生消除反應(yīng)，形成糖內(nèi)酯或醛酮糖??（圖１－３）。這種銅依賴酶通過纖維二糖脫氫酶或者小分子還原劑維生素Ｃ來進(jìn)行氧??化纖維素的作用［４（）４１，５７］。而Ｈａｒｒｉｓ等［３９］的研究發(fā)現(xiàn)ＰＭＯｓ有可能是與其他的酶系通過??協(xié)同作用來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)木質(zhì)纖維素的分解。他們利用同源表達(dá)了兩個??ＰＭＯｓ，分別為Ｔｌａｗｒａｎｒｉａｃｗｓ?ＧＨ６１和ｒＪｅｒｒｅｓＺｒｈ?ＧＨ６１Ｅ，當(dāng)將這兩個酶分別力卩至ｌｊ??７＞從．如ＳＭＡ－１３５的胞外酶系后，在相同酶量條件下可以大大提高其對纖維素的水解??效率。Ｑｕｉｎｌａｎ等［４１］研究表明ＴａＧＨ６１?Ａ對ＢＧ有強(qiáng)烈協(xié)同作用，ＢＧ本身對玉米秸稈??無水解作用
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2842486