實驗采用室內(nèi)小型堆肥反應(yīng)器以牛糞與稻草為堆肥物料進行為期一個月的高溫好氧堆肥。對堆體上、中、下層的溫度及環(huán)境溫度進行測定;對堆肥物料中纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的相對含量進行測定;利用高效液相色譜法(High pressure liquid chromatography,HPLC)測定葡萄糖含量和纖維二糖的含量;測定羧甲基纖維素酶(CMC酶)活性和β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase)活性;通過構(gòu)建β-glucosidase GH1、GH3家族基因克隆文庫的手段分析堆體中具有β-glucosidase GH1、GH3家族基因功能性微生物的群落組成和優(yōu)勢微生物種屬;利用實時熒光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR,q-PCR)判定β-glucosidase GH1、GH3家族中優(yōu)勢微生物種屬在堆肥各個時期的基因拷貝數(shù)的變化。通過分析堆肥進程中含β-glucosidase基因功能性微生物群落的演替、優(yōu)勢微生物種屬基因拷貝數(shù)的變化規(guī)律與β-glucosidase活性變化規(guī)律的相關(guān)性,進一步揭示含β-glucosidase基因功能性微生物的種類與拷貝數(shù)的變化規(guī)律與纖維素類物質(zhì)降解的潛在關(guān)系。研究結(jié)果如下:在堆肥進程中,堆體的平均溫度在前3 d,快速升溫達(dá)到45℃即進入高溫期,并維持8 d后進入降溫期最后與環(huán)境溫度變化趨于一致。纖維素的相對含量在高溫期階段變化明顯,半纖維素的相對含量變化趨勢與其相似,木質(zhì)素的相對含量總體上變化不大,且在降溫腐熟期有小幅的增加。葡萄糖含量在0-1 d呈現(xiàn)下降趨勢,在堆肥的第4 d葡萄糖含量出現(xiàn)第一個峰值(1.85 mmol/kg),第4-7 d呈現(xiàn)下降趨勢。第23 d葡萄糖的含量達(dá)到第二個峰值(5.35mmol/kg)。在第0-4 d,纖維二糖的含量的變化趨勢是先升高后降低,在高溫階段的后期和降溫腐熟的前期,纖維二糖含量一直處于較低水平,維持在0 mmol/kg-0.91 mmol/kg范圍內(nèi),與同一時期β-葡萄糖苷水解酶的較高活性相對應(yīng)。從堆肥的第13 d起,纖維二糖大量累積,在第29 d的達(dá)到最大值(1.29 mmol/kg)。β-glucosidase活性在第4 d達(dá)到整個堆肥過程中的最大值(1.482μmol p-Nitr/g dw min)并在降溫腐熟期維持在0.429μmol p-Nitr/g dw min-0.533μmol p-Nitr/g dw min范圍內(nèi);CMC酶活性變化趨勢與β-glucosidase活性相似并在第7 d達(dá)到最大值(47.67μg glucose/g dw min)。在對克隆序列進行比對分析的過程中發(fā)現(xiàn),GH1細(xì)菌家族中,k-卡拉膠降解菌屬(Devosia sp.)主要在升溫期、高溫前期和降溫腐熟期出現(xiàn);大豆根瘤菌屬(Bradyrhi zobium)和微桿菌屬(Microbacterium)在各個時期均有出現(xiàn);根瘤菌屬(Rhizobium)在各個時期均有出現(xiàn),且主要存在于高溫前期和高溫后期;棲熱孢菌屬(Thermotoga)等在高溫前期出現(xiàn)的次數(shù)較多。GH3細(xì)菌家族中,寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)在各個時期均有出現(xiàn),多數(shù)存在于升溫期中;新月形單胞菌屬(Pelosinus)在升溫期和高溫前期出現(xiàn)的次數(shù)較多;分支桿菌屬(Mycobacterium)在高溫前期、高溫后期和降溫腐熟期中均有出現(xiàn)。GH3真菌家族中,木霉屬(Hypocrea)在升溫期、高溫前期和降溫腐熟期中均有出現(xiàn),在降溫腐熟期出現(xiàn)的次數(shù)較多;曲霉屬(Aspergillus)各個時期均有出現(xiàn),在升溫期中出現(xiàn)的次數(shù)較多;青霉屬(Penicillium)主要存在于升溫期和降溫腐熟期。在對q-PCR獲得的β-glucosidase GH1家族通用引物的基因拷貝數(shù)的分析中可以發(fā)現(xiàn),升溫期和降溫腐熟期的基因拷貝數(shù)較高溫期多。分析8對β-glucosidase GH1家族特異性引物可以發(fā)現(xiàn),GH1-5-2、GH1-3-9、GH1-3-5這三對引物在q-PCR獲得的高溫期的基因拷貝數(shù)明顯高于升溫期和降溫腐熟期,說明Rhizobium和Thermotoga的基因拷貝數(shù)在高溫期與β-glucosidase的產(chǎn)生和纖維素的降解存在正相關(guān)性,即在Rhizobium和Thermotoga對β-glucosidase的產(chǎn)生和纖維素的降解起著主要作用。q-PCR獲得GH3細(xì)菌家族的4對特異性引物的基因拷貝數(shù)在升溫期都較高,在高溫期基因拷貝數(shù)較低。證明Stenotrophomonas、Pelosinus和M ycobact erium均在升溫期產(chǎn)生β-glucosidase對纖維素的降解起到一定作用,而在高溫期的作用較弱。GH3B-3這對引物在降溫腐熟期的基因拷貝數(shù)明顯高于其他三個時期,可以說明Mycobacterium在降溫腐熟期產(chǎn)生β-glucosidase和纖維素的降解過程中起到主要作用。q-PCR獲得的β-glucosidase GH3真菌家族通用引物的基因拷貝數(shù)在各個時期都處于較高水平,這與真菌是纖維素降解的主要微生物群體有關(guān)。同時,分析3對特異性引物獲得的基因拷貝數(shù)可以發(fā)現(xiàn),3對引物在q-PCR獲得的基因拷貝數(shù)在各個時期的趨勢相同,并可以看出Hypocrea、Aspergillus和Penicillium在升溫期和降溫腐熟期對β-glucosidase的產(chǎn)生和纖維素的降解起到主要作用,在高溫期的作用較弱。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S141.4;Q93
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 農(nóng)業(yè)廢棄物概述
        1.1.1 我國農(nóng)業(yè)廢棄物的現(xiàn)況
        1.1.2 目前國內(nèi)外農(nóng)業(yè)廢棄物的處理技術(shù)
        1.1.3 我國農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用的實際意義
    1.2 堆肥概述
        1.2.1 堆肥的定義及發(fā)展歷史
        1.2.2 影響好氧堆肥化的主要因素
    1.3 堆肥中纖維素的降解
        1.3.1 纖維素概述
        1.3.2 降解纖維素的微生物
        1.3.3 纖維素的降解酶類
        1.3.4 β-glucosidase概述
    1.4 堆肥微生物學(xué)的研究
        1.4.1 堆肥微生物降解的基本原理
        1.4.2 堆肥過程中微生物的群落及動態(tài)
        1.4.3 堆肥微生物學(xué)的研究方法
    1.5 本實驗研究思路的提出
    1.6 研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 堆肥材料
        2.1.2 樣品采集
        2.1.3 儀器設(shè)備與試劑
        2.1.4 實驗試劑
    2.2 試驗方法
        2.2.1 溫度測定
        2.2.2 酶活測定
        2.2.3 纖維素含量的測定
        2.2.4 葡萄糖和纖維二糖含量測定
        2.2.5 堆肥中總DNA的提取及純化
        2.2.6 目的基因的擴增
        2.2.7 β-glucos idase基因克隆文庫的構(gòu)建
        2.2.8 β-glucos idase基因q-P CR
3 結(jié)果與分析
    3.1 堆肥過程中理化性質(zhì)的變化
        3.1.1 堆肥過程中物理性質(zhì)的變化
        3.1.2 堆肥過程中化學(xué)性質(zhì)的變化
    3.2 堆肥中 β- glucos idase基因克隆文庫的構(gòu)建與分析
        3.2.1 β-glucos idase GH1家族基因克隆文庫的構(gòu)建與分析
        3.2.2 β-glucos idas e GH3細(xì)菌家族基因克隆文庫的構(gòu)建與分析
        3.2.3 β-glucos idas e GH3真菌家族基因克隆文庫的構(gòu)建與分析
    3.3 堆肥中 β- 葡萄糖苷水解酶基因?qū)崟r熒光定量PCR與分析
        3.3.1 β-glucos idas e GH1家族基因?qū)崟r熒光定量PCR與分析
        3.3.2 β-glucos idas e GH3細(xì)菌家族基因?qū)崟r熒光定量P CR與分析
        3.3.3 β-glucos idas e GH3真菌家族基因?qū)崟r熒光定量P CR與分析
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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本文編號：2836189