【摘要】：印度谷螟Plodia interpnct(Hübner)是世界性的儲(chǔ)糧害蟲,我國(guó)大部分地區(qū)都有其危害報(bào)道。本試驗(yàn)綜合運(yùn)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科知識(shí),著眼于儲(chǔ)糧害蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因稻谷產(chǎn)生抗性這一現(xiàn)實(shí)問題,以印度谷螟為研究對(duì)象,借助Illumina測(cè)序法、酶活力測(cè)定法、RT-PCR、RNA干擾等最新技術(shù),研究印度谷螟中與Bt毒素關(guān)系密切的中腸保護(hù)酶及中腸可能的Bt毒素受體—氨肽酶N和鈣黏蛋白基因,為深入了解轉(zhuǎn)Bt基因稻谷的殺蟲機(jī)理奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下:1.對(duì)印度谷螟敏感品系和Bt毒素脅迫品系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,序列經(jīng)過De novo 組裝得到 37246 個(gè) Unigene,分別有 22211 個(gè),14161 個(gè),17755 個(gè),15750個(gè),9348 個(gè),10694 個(gè) Unigene 注釋到 NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO數(shù)據(jù)庫,共23310個(gè)Unigene獲得注釋。Nr數(shù)據(jù)庫比對(duì)中發(fā)現(xiàn)印度谷螟有67.6%的基因序列比對(duì)上帝王蝶。為了進(jìn)一步研究印度谷螟對(duì)Bt毒素的抗性機(jī)理,我們對(duì)兩種品系中表達(dá)量有顯著差異的基因進(jìn)行了分析,34466條基因中有15741條在脅迫品系中表達(dá)量上升,18725條下降,而差異極其顯著的基因共有10224條。其中,有9、55、10和4條基因分別編碼APN,Cadherin,ALP和Glycolipid。其中編碼APN的基因在脅迫品系中都顯著上升,而其他3個(gè)受體基因在2個(gè)品系中并沒有明顯差別。這說明APN基因參與到了印度谷螟對(duì)Bt毒素的抗性機(jī)制中。2.微小RNA(miRNA)是參與基因調(diào)控的1組小RNA,受到越來越多的重視,然而對(duì)于印度谷螟中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的miRNA研究很少。本研究構(gòu)建了印度谷螟卵、幼蟲、蛹和成蟲共12個(gè)小RNA轉(zhuǎn)錄組文庫(每個(gè)蟲態(tài)3個(gè)重復(fù))并進(jìn)行高通量測(cè)序分析。最終,我們獲得了 173.2百萬個(gè)原始數(shù)據(jù),并確定了 1906已知的miRNA和588個(gè)新的miRNA。大多miRNA在每個(gè)蟲態(tài)中具有特異性。使用GO和KEGG對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行鑒定和注釋,并對(duì)二者的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明miRNA對(duì)印度谷螟的生長(zhǎng)發(fā)育起到了重要的調(diào)節(jié)作用,有助于從新的角度進(jìn)行印度谷螟防治技術(shù)開發(fā)。3.研究了取食轉(zhuǎn)Bt水稻后印度谷螟幼蟲體內(nèi)3種保護(hù)酶SOD(superoxide dismutase)、POD(peroxidase)和 CAT(catalase)活性的變化。結(jié)果表明,用轉(zhuǎn)Bt基因水稻短時(shí)飼喂印度谷螟后,其幼蟲體內(nèi)SOD活力開始呈上升狀態(tài),但是隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢下降,印度谷螟幼蟲取食不同濃度的轉(zhuǎn)Bt基因水稻12d和5個(gè)月后,其體內(nèi)的SOD活力受到了顯著抑制,在取食100mg/g轉(zhuǎn)Bt基因水稻5個(gè)月后,其SOD活力與對(duì)照相比下降了 38.75%,差異顯著(P0.01)。印度谷螟幼蟲在取食100mg/g轉(zhuǎn)Bt基因水稻72h內(nèi),其體內(nèi)POD活性始終低于對(duì)照組,但是在取食不同濃度的轉(zhuǎn)Bt基因水稻12d和5個(gè)月后,其POD活性與對(duì)照相比顯著增加了(P0.01)。印度谷螟幼蟲體內(nèi)的CAT活力在其取食轉(zhuǎn)Bt基因稻谷48h后開始高于對(duì)照組,并且在12d和5個(gè)月的試驗(yàn)中,其CAT活力隨著Bt毒素含量的增加而持續(xù)升高。結(jié)果說明Bt短時(shí)處理后,印度谷螟幼蟲體內(nèi)3種保護(hù)酶的增降趨勢(shì)各不相同,3種酶的平衡關(guān)系被打破了,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基水平過高,毒素對(duì)害蟲的毒殺作用便發(fā)揮了。然而長(zhǎng)期暴露于轉(zhuǎn)Bt基因水稻的印度谷螟幼蟲,其抵抗Bt脅迫的能力增強(qiáng),形成了較為完善的防御系統(tǒng)。4.利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù),克隆得到2個(gè)氨肽酶N(PiAPN1和PiAPN2)和1個(gè)鈣粘蛋白(PiCad)的基因全長(zhǎng)序列。它們的開放閱讀框分別為2847bp,2844bp和5199bp,編碼948、947和1732個(gè)氨基酸。每個(gè)蛋白質(zhì)序列的分子量分別為116.92、114.07和205.45kDa。計(jì)算出的等電點(diǎn)分別為4.78、4.90和4.18。PiAPN1、PiAPN2和PiCad都含有1個(gè)信號(hào)肽和不同數(shù)目的CR結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)PiAPN2的氨基酸序列與HaAPN具有最大的相似性(70%),而PiAPN1與其他基因具有相對(duì)較低的序列同源性。至于PiCad,其氨基酸序列與其他鱗翅目物種的已知鈣粘蛋白基因序列具有較高的相似性。5.通過qRT-PCR測(cè)定不同發(fā)育階段和Bt毒素誘導(dǎo)下的PiAPN1、PiAPN2和PiCad三種靶基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明,3個(gè)靶基因在幼蟲中的表達(dá)量顯著高于其他蟲態(tài),同時(shí)Bt毒素的誘導(dǎo)對(duì)3個(gè)靶基因的表達(dá)水平具有顯著的影響。為了進(jìn)一步探究3個(gè)基因與Bt毒素的關(guān)系,通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)分別沉默3個(gè)目標(biāo)基因,并測(cè)定特定基因沉默后昆蟲對(duì)Bt毒素的敏感性變化,結(jié)果表明,微量注射法成功干擾3個(gè)目標(biāo)基因,造成基因表達(dá)量顯著下調(diào)。3個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)造成印度谷螟對(duì)Cry1Ab毒素的敏感性顯著下降(P0.05)。證明PiAPN1、PiAPN2和PiCad基因與印度谷螟對(duì)Cry1Ab的抗性機(jī)制密切相關(guān)。
【圖文】：

械模胖搗植跡嚅頤強(qiáng)梢鑰吹劍玻埃醶擔(dān)サ淖⑹托蛄校]3?Ｅ值小于１．０Ｅ－１００，邋１５．５％注釋序列Ｅ值范圍在１．０Ｅ－１００到１．０Ｅ－６０之間，二者逡逑之間具有強(qiáng)同源性（圖２．２）。序列相似性分布表明，２６．１邋％的序列有８０％甚至逡逑更高的同源性，而７３．９％的序列同源性在１７％－８０％之間。至于物種，與本試蟲逡逑相似度最高的是美國(guó)帝王蝶（Ａｍｅｒｉｃａｎ邋ｍｏｎａｒｃｈ，邋６７．６０％），其次是家香（■Ｂｏｍｆｔｙｘ逡逑ｍｗ＾，６．５％）、赤擬谷盜（７ｈ＇》ｏ＂ｗｗｃａｙｔｏ７ｅｗｗ，３．４％）等（圖邋２．２）。逡逑表２．３注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．３邋Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ逡逑Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋Ｆｉｌｅ邋ＮＲ邋ＮＴ邐Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ邐ＫＥＧＧ邐ＣＯＧ邋ＧＯ邋ＡＬＬ逡逑Ａｌｌ－Ｕｎｉｇｅｎｅ邐２２，２１１邐１４，，１６１邐１７，７５５邐１５，７５０邐９３４８邐１０，６９４邐２３，３１０逡逑■邋Ａｍｅｒｉｃａｎ邋ｍｏｎａｒｃｈ逡逑２－

圖２．４邋ＣＯ?
【學(xué)位授予單位】：南京財(cái)經(jīng)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S379.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2673890