蛋白泛素化修飾是一種在真核生物多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用的翻譯后修飾形式,是靠E3泛素連接酶對(duì)關(guān)鍵基因的精確識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能的多樣性和特異性。研究表明,在植物低磷脅迫應(yīng)答相關(guān)的根系形態(tài)建成、磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及激素代謝等過(guò)程中蛋白泛素化修飾都發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用。本研究以橡膠樹組培苗為材料構(gòu)建了地上部地下部均一化酵母雙雜交cDNA文庫(kù),以前期通過(guò)抑制差減雜交(SSH)獲得的2個(gè)低磷脅迫應(yīng)答相關(guān)的E3泛素連接酶基因HbSIN4T2、HbTIR1構(gòu)建誘餌載體,并通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)分別篩選了互作蛋白。繼而克隆獲得互作蛋白的cDNA全長(zhǎng),并通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)互作蛋白進(jìn)行了分析,以期探索這些E3泛素連接酶基因在橡膠樹低磷脅迫應(yīng)答中的調(diào)控作用。主要的研究成果如下:1.構(gòu)建了橡膠樹地上部均一化cDNA文庫(kù),文庫(kù)滴度8×107cfu/mL,所得文庫(kù)插入片段≥0.5 kb的重組率為100%;2.構(gòu)建了橡膠樹地下部均一化cDNA文庫(kù),文庫(kù)滴度7×107cfu/mL,所得文庫(kù)插入片段≥0.5 kb的重組率為87%;3.構(gòu)建了兩個(gè)與低磷脅迫應(yīng)答相關(guān)的E3泛素連接酶誘餌載體HbSIN4T2、HbTIR1;4.利用酵母...

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１橡膠樹地上部（Ａ）和地下部（Ｂ）總ＲＮＡ??

膠樹低磷脅迫相關(guān)Ｅ３泛素連接酶底物的篩３結(jié)果與分析??部地下部均一化酵母雙雜交ｃＤＮＡ和地下部總ＲＮＡ的提取??續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的ｍＲＮＡ，總ＲＮＡ的質(zhì)ＣＴＡＢ法（淦國(guó)英等，２００９；郭秀蓮等，ＲＮＡ。然后通過(guò)１．２％瓊脂糖凝膠電泳ｒＲＮＡ和２８ＳｒＲＮＡ條帶清楚（圖丨），ＲＮＡ沒(méi)有降....

圖２地上部（Ａ）地下部（Ｂ）均一化之后（１）和均一化之前（２）的ｃＤＩＮＡ檢測(cè)結(jié)果??Ｎｋｅｒ

３．１．３?ｄｓ－ｃＤＮＡ的合成及ＤＳ＿—化效果??以３．０ｐＬｍＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，然后經(jīng)兩輪ＬＤ－ＰＣＲ擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)結(jié)??果顯示ｄｓ－ｃＤＮＡ呈彌散狀，片段分布較廣，且豐度各異（圖２）。由此表明，大小??不一和豐度各異的ｍＲＮＡ都得到了預(yù)期的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。??ｄｓ－ｃ....

圖３地上部（１和２）和地下部（３和４）均一化前后１８ＳｒＲＮＡ表達(dá)豐度變化檢測(cè)??＿

用管家基因１８Ｓ?ｒＲＮＡ分別對(duì)地上部和地下部ＤＳＮ均一化前以及均一化并過(guò)柱純化??后的ｃＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。經(jīng)擴(kuò)增３０個(gè)循環(huán)后，ＤＳＮ均一化處理后的ｃＤＮＡ中，??１８ＳｒＲＮＡ基因的表達(dá)豐度均明顯低于均一化之前（圖３）。以上結(jié)果表明，均一化??處理有效地降低了高豐度基因，過(guò)柱....

圖５地下部均一化文庫(kù)的菌落生長(zhǎng)情況??－

３．１．４均一化酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)??過(guò)柱純化后的ｄｓ－ｃＤＮＡ和線性化質(zhì)粒ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ共轉(zhuǎn)化Ｙ１８７感受態(tài)細(xì)胞，??轉(zhuǎn)化后的菌落生長(zhǎng)情況如圖４和圖５所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，初始文庫(kù)獨(dú)立克隆地上??部為２．２８ｘｌ〇６ｃｆｕ，地下部為２．０４ｘｌ〇６ｃｆｕ，取收集后....

本文編號(hào)：4028453