天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。白粉病是橡膠樹的重要葉部病害,嚴(yán)重影響天然橡膠的產(chǎn)量和質(zhì)量。在前期研究中,我們利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)橡膠樹葉片受白粉病菌侵染前后的基因差異表達(dá)情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)編號(hào)為CL13480和CL406的cDNA序列在白粉病菌侵染前后的橡膠樹葉片中的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化,分別將其命名為HbGNOM和HbFER。在此基礎(chǔ)上,本研究對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆和相關(guān)的功能分析,具體結(jié)果如下:1.HbGNOM基因的cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)為4410bp,編碼一個(gè)含1470氨基酸的蛋白。生物信息學(xué)表明橡膠樹HbGNOM基因的編碼蛋白含有Sec7保守結(jié)構(gòu)域,與麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)、木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)以及擬南芥(Arabidopsis thaliana)的GNOM蛋白高度相似,其相似性分別為97%、96%、95%和84%。半定量分析結(jié)果表明HbGNOM基因在葉片中的表達(dá)受植物激素乙烯(ET)的誘導(dǎo),但對(duì)水楊(SA)、茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)的處理沒(méi)有明顯應(yīng)答。當(dāng)橡膠樹受到白粉病菌侵染時(shí),HbGNOM基因在葉片中的表達(dá)明顯升高,但對(duì)炭疽病菌的侵染不產(chǎn)生應(yīng)答。以上結(jié)果暗示HbGNOM參與橡膠樹對(duì)白粉病的抗病反應(yīng),可能與乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明,HbGNOM蛋白定位在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。2.在前期研究中,實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆了橡膠樹HbFER基因的全長(zhǎng),生物信息學(xué)分析表明HbFER基因全長(zhǎng)2679 bp,編碼一個(gè)長(zhǎng)892個(gè)氨基酸的多肽,包含Malectin_like和PTKc兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,半定量表達(dá)分析結(jié)果表明PAMPs分子鞭毛蛋白(flg22)和幾丁質(zhì)(Chitin)能夠抑制HbFER基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步研究了HbFER基因的表達(dá)模式。橡膠樹接種白粉病菌能夠明顯誘導(dǎo)HbFER基因的上調(diào)表達(dá),而接種炭疽病菌的橡膠樹葉片中HbFER基因的表達(dá)沒(méi)有明顯變化;水楊酸(SA)和赤霉素(GA)處理橡膠樹葉片能夠誘導(dǎo)HbFER基因的表達(dá),但茉莉酸(JA)、乙烯(ET)、脫落酸(ABA)處理對(duì)HbFER基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,HbFER蛋白定位在細(xì)胞膜上。以上結(jié)果表明,HbFER基因參與橡膠樹對(duì)白粉病的抗性,與SA和GA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān),與JA、ET、ABA信號(hào)途徑關(guān)系不大。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S763.7
【部分圖文】：

?基因片段全長(zhǎng)的克隆??利用引物ＨｂＧＮＯＭ－Ｆ、ＨｂＧＮＯＭ－Ｒ，通過(guò)ＲＴ－ＰＣＲ的方法對(duì)冊(cè)ＧｉＶＯＭ基因的??全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖２。從圖中可以看到，在大??約４５００ｂｐ處有單一條帶，與預(yù)期基因片段條帶大小一致。序列測(cè)定結(jié)果表明該片段??長(zhǎng)度為４４１０ｂｐ，是一個(gè)完整性的開放性閱讀框，編碼一個(gè)１４７０個(gè)氨基酸的多肽（圖??３）。?Ｍ?１??Ｉ??圓??圖２冊(cè)ＧＭＷ／基因的ｃＤＮＡ全長(zhǎng)擴(kuò)增（Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ５０００；?１：?／ＷＧＴＶＯＭ基因ｃＤＮＡ片段）??Ｆｉｇ．?２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｕｌｌ?ｌｅｎｇｔｈ?ＨｂＧＮＯＭ?ｃＤＮＡ?ｂｙ?ＲＴ－ＰＣＲ??（Ｍ：?Ｌａｄｄｅｒ?５０００；?１：?ｃＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?ｏｆ?ＨｂＧＮＯＭ）??１６??

本實(shí)驗(yàn)采用ＣＴＡＢ－ＬｉＣｌ大提法提取橡膠樹葉片的ＲＮＡ，并將提取的ＲＮＡ溶于??ＤＥＰＣ處理過(guò)的無(wú)離子水中，取適量的ＲＮＡ樣品進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果??見圖１。從圖中可以清楚看到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ三條特異條帶，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)的??ＯＤ２６〇／ＯＤ２８〇的比值在１．９－２．１范圍之內(nèi)，適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。??２Ｓｓ－ｐ＊Ｗ＾??丨‘卞－??必，＇??二??圖１橡膠樹葉片總ＲＮＡ的提取??Ｆｉｇ．?１?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｌｅａｆ?ｏｆ?Ｈｅｖｅａ?ｂｒａｓｉｈｅｎｓｉｓ??２．１．２?基因片段全長(zhǎng)的克隆??利用引物ＨｂＧＮＯＭ－Ｆ、ＨｂＧＮＯＭ－Ｒ，通過(guò)ＲＴ－ＰＣＲ的方法對(duì)冊(cè)ＧｉＶＯＭ基因的??全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖２。從圖中可以看到，在大??約４５００ｂｐ處有單一條帶，與預(yù)期基因片段條帶大小一致。序列測(cè)定結(jié)果表明該片段??長(zhǎng)度為４４１０ｂｐ，是一個(gè)完整性的開放性閱讀框，編碼一個(gè)１４７０個(gè)氨基酸的多肽（圖??３）。?Ｍ?１??Ｉ??圓??圖２冊(cè)ＧＭＷ／基因的ｃＤＮＡ全長(zhǎng)擴(kuò)增（Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ５０００；?１：?／ＷＧＴＶＯＭ基因ｃＤＮＡ片段）??Ｆｉｇ．?２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｕｌｌ?ｌｅｎｇｔｈ?Ｈ

２．４．１亞細(xì)胞定位載體ｐＵＣ１９－３５ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ的構(gòu)建??構(gòu)建ＨｂＧＮＯＭ蛋白亞細(xì)胞定位的重組載體ｐＵＣ〗９－３５ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ，重組載??體的酶切鑒定結(jié)果見圖８。圖中可以看出，通過(guò)＆／Ｉ和５說(shuō)６?Ｉ雙酶消化得到的片段與??預(yù)期的片段大小相符，說(shuō)明ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ融合基因己經(jīng)重組到表達(dá)載體上。測(cè)序驗(yàn)??證后用于后續(xù)分析。??４〇〇〇ｂ＂Ｌｆ??圖８重組載體ｐＵＣ１９－３５ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ的雙酶切鑒定??（Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?１００００；?１：心／?Ｉ和仍幼Ｉ的雙酶切）??Ｆｉｇ．?８?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＵＣ１９－３５Ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ?ｂｙ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??２２??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2869519