發(fā)布時間：2020-10-20 20:34

　　 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)通過對底物蛋白的泛素化修飾和降解調(diào)節(jié)絕大多數(shù)代謝過程。APC/C復(fù)合體是一類重要的泛素連接酶,與細胞分裂直接相關(guān),而APC10是APC/C復(fù)合體的核心亞基,參與細胞衰老、細胞分化等過程。盡管UPS的重要功能在模式植物中已經(jīng)得到廣泛的證明,但在橡膠樹中有關(guān)UPS的研究鮮有報道。本研究在篩選和鑒定橡膠樹白粉菌響應(yīng)相關(guān)基因中,發(fā)現(xiàn)HbAPC10基因受白粉菌誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達。為了全面解析HbAPC10基因在橡膠樹中的功能,本研究以橡膠樹熱研7-33-97膠乳為材料,提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,克隆出HbAPC10基因,并采用Q-PCR技術(shù)系統(tǒng)地分析HbAPC10在橡膠樹白粉菌侵染、外源激素處理和脅迫下的表達模式;分析其結(jié)構(gòu)并通過亞細胞定位和apc10ts突變體互補實驗證明HbAPC10是APC/C的亞基,具有保守功能;并構(gòu)建高質(zhì)量膠乳均一化酵母雙雜交cDNA文庫,將HbAPC10構(gòu)建到酵母表達載體pGBKT7并轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold成誘餌菌株HbAPC10-bait-Y2H Gold,用該誘餌菌株與酵母雙雜交cDNA文庫雜交篩選與HbAPC10互作的蛋白,并通過酵母雙雜交驗證HbAPC10與互作蛋白的互作關(guān)系,并進一步分析互作蛋白基因在橡膠樹白粉菌侵染、外源激素處理和脅迫下的表達模式,結(jié)果如下:1. HbAPC10響應(yīng)橡膠樹白粉菌、外源激素和脅迫處理,可能在橡膠樹抗病、抗逆中起作用。表達模式分析發(fā)現(xiàn),在橡膠樹各組織中均有表達,并且在葉片中高表達,表明其功能主要和葉片相關(guān);HbAPC10在橡膠樹白粉菌處理時,0-3 h下調(diào)表達,6-72 h上調(diào)表達,72 h表達量最高;在外源激素(茉莉酸甲酯,MeJA: jasmonates;脫落酸,ABA: abscisic acid;乙烯利,ETH: ethylene,)處理時均上調(diào)表達,6-10 h表達量最高;在傷害處理時均上調(diào)表達6-10 h表達量最高;在泛素化抑制劑MG132處理時上調(diào)表達,在72 h表達量最高;說明HbAPC10可能在橡膠樹抗病、抗逆中起作用。2.HbAPC10的開放性閱讀框(ORF)為579bp,編碼192個氨基酸,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其具有一個保守的APC10保守結(jié)構(gòu)域。3.采用煙草瞬間表達技術(shù)分析HbAPC10的亞細胞定位,通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白35S:XXGFP-HbAPC10定位于細胞核中。4. HbAPC10能夠恢復(fù)溫度敏感型裂殖酵母突變體apc10ts的功能,使其能夠在嚴(yán)格溫度(35℃)條件下正常生長,表明HbAPC10是一個具有功能的APC10蛋白,不同物種的APC10具有保守的功能。5.酵母雙雜交文庫篩選獲得兩個與HbAPC10互作的蛋白HbSRPP和HbPRS4。HbSRPP是天然橡膠生物合成關(guān)鍵酶,HbPRS4編碼磷酸核糖焦磷酸激酶。進一步采用點對點的酵母雙雜交技術(shù)驗證HbAPC10與HbSRPP、HbPRS4的互作關(guān)系,表明HbAPC10可能通過與天然橡膠生物合成關(guān)鍵酶HbSRPP互作,參與調(diào)控天然橡膠合成和防御反應(yīng)。6.系統(tǒng)進化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)HbPRS4屬于Ⅱ型的PRS,與菠菜SoPRS4和擬南芥AtPRS4高度同源。表達模式分析發(fā)現(xiàn),HbPRS4在橡膠樹各組織中均有表達,并且樹皮中特異性表達,表明其功能主要和樹皮相關(guān);橡膠樹白粉菌處理時,HbPRS4在0-3 h上調(diào)表達,6-24 h表達量維持不變,48 h表達量最高,48-72h下調(diào)表達至4倍表達水平;外源ABA和傷害處理時,HbPRS4下調(diào)表達;ETH和MeJA處理后HbPRS4上調(diào)表達;MG132誘導(dǎo)HbPRS4上調(diào)表達MG132,說明HbPRS4參與響應(yīng)橡膠樹白粉菌侵染、多種外源脅迫和防御反應(yīng)。本研究闡明HbAPC10參與橡膠樹抗病和抗逆反應(yīng)、細胞分裂和天然橡膠合成等多個過程,為研發(fā)橡膠樹產(chǎn)量調(diào)控技術(shù)和抗病育種提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S763
【部分圖文】：

在擬南芥中發(fā)現(xiàn)兩種Ｅｌｓ，至少３７種Ｅ２ｓ和１４００種Ｅ３ｓ（Ｖｉｅｒｓｔｒａ，２００９）。??Ｅ３ｓ由多個基因家族編碼合成，根據(jù)泛素從Ｅ２轉(zhuǎn)移到底物過程的機制差異，將??其分為ＨＥＣＴ－Ｅ３Ｓ和（ＲＩＮＧ）?／Ｕ－ｂｏｘＥ３ｓ兩種，如圖１所示。Ｅ３ｓ在泛素化過??程中可以是單個或是多個亞基共同作用（Ｐｉｃｋａｒｔ，２００１）。在擬南芥基因組中，??ＨＥＣＴ－Ｅ３Ｓ是最小的結(jié)構(gòu)域，（ＲＩＮＧ）?／Ｕ－ｂｏｘ?Ｅ３ｓ是與Ｅ２互作最多的結(jié)構(gòu)域??（Ｓｍａｌｌｅ?ａｎｄ?Ｖｉｅｒｓｔｒａ，２００４；?Ｓｔｏｎｅ?ｅｔａｌ．，２００５）。ＨＥＣＴ－Ｅ３Ｓ?包含泛素結(jié)合區(qū)域??和Ｅ２結(jié)合區(qū)域，（ＲＩＮＧ）／Ｕ－ｂｏｘ?Ｅ３ｓ包含ＳＣＦ復(fù)合體、ＥＣＳ復(fù)合體、ＣＵＬ３－ＢＴＢ??復(fù)合體、ＣＵＬ４－ＤＤＢ和ＡＰＣ復(fù)合體，不同復(fù)合體由它們的多亞基共同作用特??異性識別和結(jié)合底物，其中ＳＣＦ復(fù)合酶體是（ＲＩＮＧ）?／Ｕ－ｂｏｘ?Ｅ３ｓ中最多的復(fù)??合酶體（Ｐｅｔｒｏｓｋｉ?ａｎｄ?Ｄｅｓｈａｉｅｓ，２００５）。??２??

替代內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)泛素化以及胞質(zhì)泛素連接酶，泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ＵＰＳ?）??導(dǎo)向新的耙標(biāo)，防止進一步擴大感染（Ｖｅｒｃｈｏｔ，２０１６）。??現(xiàn)在證實ＵＰＳ是激素信號調(diào)節(jié)中心（Ｓａｄａｎａｎｄｏｍｅｔａｌ．，２０１２），如圖２所??４??

ａｓｅ－ｒｅｅ２｜ｉＴｏｔａｌ?２０?｜ｉＬ??°Ｃ，１５ｍｉｎ?；?８５°Ｃ，５?ｓ，稍離心，－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??不同組織ｃＤＮＡ稀釋成相同濃度作為模板，用／／－Ｆ＼?５；－ＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣ－３；，Ｈｂｌ８ＳｒＲＮＡＧＡＣＣＡＴＡＣ－３，）作內(nèi)參基因（Ｃｈａｏ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）進行?，進行電泳檢測，保存結(jié)果。??體系如下：??ｃＤＮＡ?１??２＞＜ＴａｑＭｉｘ?９?ｊｘＬ??Ｈｂｌ８ＳｒＲＮＡ－Ｆ?１??Ｈｂｌ８ＳｒＲＮＡ－Ｒ?１??ｄｄ?Ｈ２０?８（ｘＬ??Ｔｏｔａｌ?２０?（ｊ，Ｌ??程序如下：??ｉ??＾３０?ｃｙｃｌｅｓ?ｉ??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 覃碧;劉長仁;杜磊;;橡膠樹死皮(TPD)發(fā)生過程中膠乳蛋白質(zhì)的泛素化[J];植物生理學(xué)報;2013年03期

2 曾日中,段翠芳,黎瑜,郝秉中;茉莉酸刺激的橡膠樹膠乳cDNA消減文庫的構(gòu)建及其序列分析[J];熱帶作物學(xué)報;2003年03期

3 劉惠芳,吳繼林,郝秉中;茉莉酸和其它激素對巴西橡膠樹乳管分化的協(xié)同作用[J];熱帶作物學(xué)報;2001年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 趙悅;巴西橡膠樹乳管細胞茉莉酸信號途徑對橡膠生物合成調(diào)節(jié)的研究[D];海南大學(xué);2011年

本文編號：2849128