植物各級(jí)葉脈彼此聯(lián)通的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在葉的形態(tài)、大小、空間分布及生物量中扮演重要角色。研究已證明諸多轉(zhuǎn)錄因子、酶分子和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子參與或調(diào)控葉脈的形態(tài)建成。白樺(Betula platyphylla)為高大落葉喬木,由于其枝葉扶疏、樹(shù)皮潔白,具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值,被廣泛應(yīng)用于庭院觀賞和園林綠化。葉脈的形態(tài)建成對(duì)于白樺生長(zhǎng)發(fā)育具有重大的意義。目前,關(guān)于樺樹(shù)葉脈發(fā)育的分子模型仍鮮見(jiàn)報(bào)道。為了挖掘調(diào)控葉脈發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,本研究以歐洲白樺(B.pendula)的種內(nèi)變種-裂葉樺(B.penudula 'Dalecarlica')為取材對(duì)象。在裂葉樺葉脈解剖結(jié)構(gòu)觀察的基礎(chǔ)上,以頂芽(DS0)和由幼嫩至成熟的不同發(fā)育階段主脈(DS1、DS2、DS3、DS4、DS5和DS6)為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,構(gòu)建基于Bottom-upgraphic Gaussian model(GGM)模型的白樺葉脈遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了驗(yàn)證來(lái)自葉脈遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的差異表達(dá)基因的功能,本研究通過(guò)白樺轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)2個(gè)Plant Homeodomain(BpPHD3和BpPHD4)基因進(jìn)行功能分析。主要研究結(jié)果如下:(1)裂葉樺主葉脈的解剖結(jié)構(gòu)觀察顯示:基本組織、木質(zhì)部、韌皮部、形成層和機(jī)械組織是主脈的主要組成成分。隨著主脈的發(fā)育成熟,主脈各組成成分的厚度逐漸增大。其中,機(jī)械組織厚度與主脈厚度由DS1至DS6發(fā)育階段的生長(zhǎng)變化規(guī)律一致。裂葉樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),DS1和DS4發(fā)育階段主脈中的差異基因數(shù)量最多。此外,葉脈遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示,BpPHD3和BpPHD4基因在頂芽中低表達(dá),在主脈中隨著主脈的生長(zhǎng)發(fā)育其表達(dá)量依次升高。(2)從白樺組織克隆得到BpPHD3和BpPHD4基因。序列分析顯示:BpPHD3的開(kāi)放閱讀框?yàn)?389bp,編碼462個(gè)氨基酸,具有典型的Plant Homeodomain-Like(PHD-L)保守結(jié)構(gòu)域;BpPHD4的開(kāi)放閱讀框?yàn)?323 bp,編碼440個(gè)氨基酸,具有典型的PHD-L保守結(jié)構(gòu)域。(3)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別獲得BpPHD3過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)白樺株系。表型分析發(fā)現(xiàn),與野生型白樺相比,過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系的苗高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積和葉體積均降低,尤其過(guò)表達(dá)株系降低程度明顯。葉表皮細(xì)胞方面,過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系的葉表皮細(xì)胞變大、數(shù)量降低。在葉片厚度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上,過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系表現(xiàn)不同。過(guò)表達(dá)株系的葉片厚度變薄,同時(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)如上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮的厚度均變小;而抑制表達(dá)株系的葉片變厚,內(nèi)部結(jié)構(gòu)除下表皮以外的厚度均增大。葉脈性狀上,過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系的主脈長(zhǎng)度、二級(jí)脈數(shù)量及脈間距均變小,而主脈與二級(jí)脈間的夾角變大。主脈直徑在過(guò)表達(dá)株系中降低,而在抑制表達(dá)株系中升高。內(nèi)源激素含量測(cè)定結(jié)果顯示,生長(zhǎng)素IAA(Indoleacetic Acid)含量在過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系葉片中均降低。細(xì)胞分裂素ZR(Zeatin Riboside)含量在過(guò)表達(dá)株系葉片中顯著降低,而在抑制表達(dá)株系中顯著升高。主脈中,IAA和ZR含量在過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系中均顯著降低。二級(jí)脈中,IAA含量在過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系中顯著降低。ZR含量在過(guò)表達(dá)株系二級(jí)脈中降低,而在抑制表達(dá)株系中升高�；钚匝鯗y(cè)定發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)株系葉片內(nèi)的活性氧積累均不同程度的增加,其中,過(guò)表達(dá)株系的活性氧積累最多。由葉脈發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)特性分析可知,許多與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因表達(dá)量在BpPHD3轉(zhuǎn)基因白樺葉片中發(fā)生了明顯改變。其中,與細(xì)胞周期相關(guān)的基因在過(guò)表達(dá)株系中呈下調(diào)表達(dá),而在抑制表達(dá)株系中呈上調(diào)表達(dá)。(4)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別獲得BpPHD4過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)株系。表型分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照白樺相比,過(guò)表達(dá)株系的苗高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積、葉厚度和葉體積均降低;上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度均減少;葉表皮細(xì)胞變小、細(xì)胞數(shù)量增加;葉片內(nèi)的IAA和ZR含量均降低;葉片內(nèi)的活性氧積累增加;主脈長(zhǎng)度、二級(jí)脈的數(shù)量和主脈直徑均降低;主脈和二級(jí)脈的IAA和ZR含量均降低。然而,抑制表達(dá)株系在以上性狀上與超表達(dá)株系呈現(xiàn)相反的結(jié)果。由葉脈發(fā)育基因表達(dá)特性分析可知,許多與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因表達(dá)量在BpPHD4轉(zhuǎn)基因白樺中發(fā)生了明顯改變。其中,與細(xì)胞周期相關(guān)的基因在過(guò)表達(dá)株系葉片中呈上調(diào)表達(dá),而在抑制表達(dá)株系中下調(diào)表達(dá)。(5)BpPHD4過(guò)表達(dá)白樺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,多數(shù)與細(xì)胞壁組成、防御機(jī)制和生長(zhǎng)素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因呈下調(diào)表達(dá);與細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞周期、染色體結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因呈上調(diào)表達(dá)。將BpPHD4過(guò)表達(dá)白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與歐洲白樺基因組相結(jié)合預(yù)測(cè)BpPHD4的靶基因,28條涉及防御機(jī)制、細(xì)胞周期、植物激素及其它發(fā)育過(guò)程的基因?yàn)楹蜻x靶基因。綜上所述,在白樺葉脈遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,BpPHD3和BpPHD4是葉片形態(tài)發(fā)生和葉脈發(fā)育過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子成員。其中,BpPHD3通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素穩(wěn)態(tài)、葉脈發(fā)育基因的表達(dá)和活性氧的積累從而改變?nèi)~片大小和脈絡(luò)結(jié)構(gòu)特征;BpPHD4通過(guò)抑制內(nèi)源激素合成、增加活性氧的積累及調(diào)控葉脈發(fā)育基因的表達(dá)從而抑制葉片和葉脈的發(fā)育。本研究從分子生物學(xué)角度分析了白樺葉脈發(fā)育的分子模型,探討了葉脈形成與發(fā)育的分子機(jī)制。本研究結(jié)果不僅可以豐富植株葉片形態(tài)建成的基礎(chǔ)理論,也為植物葉片的分子設(shè)計(jì)和品種改良提供參考。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S792.153
【部分圖文】：

計(jì)算機(jī)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因突變、基因編輯等多種手段，一系列參與葉脈形態(tài)建成逡逑和發(fā)生的遺傳調(diào)控基因已相繼被識(shí)別［２２＿３（），５５＿５６］。逡逑１．３．１葉原基發(fā)育逡逑葉原基細(xì)胞的維持、分裂與分化的能力是植物形態(tài)建成起始和發(fā)生的必備條件［５５］。逡逑在遺傳學(xué)水平上，葉原基的形成和發(fā)育依賴于多遺傳因子與生長(zhǎng)素通過(guò)相互協(xié)調(diào)的作用逡逑方式組成復(fù)雜而精細(xì)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖１邋－１）［５６］。在此調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，（ＰＨＯｉＪＭＥＤ逡逑７）基因分布于ＳＡＭ的外表皮細(xì)胞中，主要負(fù)責(zé)引導(dǎo)生長(zhǎng)素從底端向分生組織的頂端逡逑運(yùn)輸［５６］。ＸＴＶＯＷ邐欣ｅ邋／ｚｏｗｅｏＺｗｘ邋７）基因是維持植物分生組織分化能力逡逑和起始發(fā)育的關(guān)鍵因子［１，５６］。在整個(gè)ＳＡＭ中，？９Ｘ７基因表達(dá)位置分布廣泛，其表達(dá)逡逑受生長(zhǎng)素的濃度水平調(diào)節(jié)。NBＳ７邐基因是已知的葉極性建立的關(guān)逡逑鍵因子之一［５７］，其與生長(zhǎng)素共同抑制Ｋ９Ｘ基因家族的說(shuō)５邐五ＺＺｔ／幻基逡逑因的表達(dá)活性，從而促進(jìn)嫩葉組織從葉原基中不斷分離。在葉原基發(fā)育過(guò)程中，負(fù)逡逑向調(diào)控幻ＶＱＴ基因家族的兄４＃７７邐欣ｅ邋２）和尤沿－／汝ｅ邋（５）的表達(dá)逡逑水平［１’坤。與此同時(shí)，／ＱＶＯＸ基因家族的再進(jìn)一步抑制逡逑ＡＳ７的表達(dá)量［５６］。由此可見(jiàn)，眾多基因與生長(zhǎng)素及其信號(hào)分子的協(xié)同與拮抗作用從分子逡逑水平維持頂端分生組織的分裂活性并促進(jìn)新的側(cè)生器官?gòu)娜~原基中不斷分離［４２］。逡逑

對(duì)葉片形態(tài)發(fā)生和葉脈發(fā)育的分子功能，為木本植物葉脈及維管發(fā)育提供參考依據(jù)。逡逑１．５．２技術(shù)路線逡逑本研究的技術(shù)路線如圖１－４所示。逡逑裂葉樺逡逑Ｉ￣￣＇邐邐逡逑頂芽邋１邐｜不同發(fā)育階段逡逑＾．邋Ｔ邐———＾邐１邋■逡逑轉(zhuǎn)錄纟ｉ測(cè)序邐丨邐Ｉ邋形態(tài)學(xué)觀察￣逡逑邐邋小邐邐逡逑Ｂｏｔｔ

２．３．１裂葉樺主灥剖學(xué)觀察逡逑本研宄中，我們采用解剖學(xué)觀察方法追蹤裂葉樺主脈由幼嫩至成熟的形態(tài)特點(diǎn)。結(jié)逡逑果（圖２－４）表明，基本組織（ＧＴ）、木質(zhì)部（Ｘ）、初皮部（Ｐｈ）、形成層（Ｃａ）和機(jī)逡逑械組織（ＭＴ）是裂葉樺主脈的重要組成成分，在不同發(fā)育階段，這些組成成分呈現(xiàn)不逡逑同的形態(tài)特征。在主脈橫切面上，被番紅染成紅色的拱形狀木質(zhì)部由徑向規(guī)則排列的導(dǎo)逡逑管分子構(gòu)成，拱形木質(zhì)部外側(cè)為韌皮部。ＤＳ１發(fā)育階段的導(dǎo)管細(xì)胞較小、排列不規(guī)則，逡逑此發(fā)育階段的木質(zhì)部與初皮部分界不明顯。ＤＳ２發(fā)育階段導(dǎo)管細(xì)胞排列趨于規(guī)則，與幵逡逑皮部分界明顯。ＤＳ３至ＤＳ６發(fā)育階段方面，導(dǎo)管細(xì)胞排列完全規(guī)則，與幵皮部分界明逡逑顯。木質(zhì)部與韌皮部由形成層連接，ＤＳ１發(fā)育階段的主脈形成層與木質(zhì)部、韌皮部緊密逡逑結(jié)合，其余發(fā)育階段的形成層能夠在顯微水平肉眼可見(jiàn)。拱形狀木質(zhì)部?jī)?nèi)側(cè)為支撐葉片逡逑的機(jī)械組織

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2832828