銀杏(Ginkgo biloba L.)是我國獨有的孑遺樹種。其樹姿優(yōu)美、壽命長、抗病蟲、適應(yīng)性強、觀賞價值高,在我國分布極廣,是重要的園林綠化樹種,在許多地區(qū)均有樹齡超過千年的古銀杏。這些生長千年的銀杏也被譽為“國之瑰寶、綠色文物”。目前對古銀杏的研究還較為滯后,許多科學問題亟待解決,如銀杏生長千年而不衰的分子機制,古銀杏出現(xiàn)衰退跡象的影響機制依然未知。本研究在建立銀杏葉片蛋白提取及雙向凝膠電泳體系的基礎(chǔ)上,對銀杏隨著樹齡增長其生理學指標及蛋白表達的差異特征進行探討,為進一步深入分析和挖掘銀杏抗衰老過程中的差異蛋白表達及參與的代謝途徑提供了參考。主要結(jié)果如下:通過比較TCA/丙酮沉淀、Tris-HCl緩沖液提取和SDS-苯酚三種提取方法的原理、蛋白質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量、雙向凝膠電泳圖譜(蛋白點數(shù)量及分辨度),我們發(fā)現(xiàn):TCA/丙酮法蛋白沉淀量很多,但其溶解程度差、雙向電泳圖譜中蛋白點較少;Tris-HCl提取法與SDS-苯酚蛋白沉淀量及蛋白溶解程度差異不大,但Tris-HCl法所制備的樣品在2-DE圖譜中蛋白點較少,SDS-苯酚法所提取的蛋白質(zhì)在2-DE圖譜的水平和垂直方向均產(chǎn)生最清晰的蛋白點。故而,以SDS-苯酚提取法最佳。對黃柏塬20年、600年和1200年的銀杏葉片的生理進行測定,結(jié)果顯示,不同樹齡銀杏葉片的生理活性存在明顯差異:相對于20年和600年生銀杏,1200年生的古銀杏葉組織中葉綠素、可溶性蛋白含量顯著下降,MDA含量顯著升高,SOD和POD活性下降,表明隨著樹齡的增長,銀杏古樹在葉片生理指標方面出現(xiàn)衰老癥狀。對樓觀臺和黃柏塬不同樹齡銀杏葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳及圖譜分析結(jié)果顯示:銀杏葉片中的蛋白分子質(zhì)量大多分布在20~50kDa之間,而蛋白的等電點主要集中分布在pH5~pH 6.5;從蛋白點的三維峰圖可直觀地看出,蛋白點1731、2520的豐度均隨著樹齡增加而升高,而蛋白點3312的豐度隨著樹齡增加而減少;在黃柏塬不同樹齡銀杏葉片的2-DE圖譜中共挑出36個顯著差異蛋白點,通過聚類分析可將其歸為四個大類,Ⅰ組中包含的4個蛋白點在20年生銀杏中未檢測到,但在600年及1200年生銀杏葉片中表達量很高;Ⅱ組中包含的12個蛋白質(zhì)均上調(diào)表達,但在600年和1200年生銀杏葉片中表達量差異不大;Ⅲ組中涉及到11個蛋白質(zhì)均隨著年齡增大呈下調(diào)表達;Ⅳ組中包含的9個蛋白質(zhì),在1200年生銀杏中表達量最高。對樓觀臺銀杏葉中獲取的差異蛋白點進行MALDI TOF/TOF MS/MS分析,共鑒定出30種差異蛋白質(zhì)。根據(jù)http://www.uniprot.org/查詢的這些蛋白質(zhì)功能注釋,將其劃分為8個功能組,包括能量和碳水化合物代謝、光合作用、脅迫響應(yīng)、蛋白質(zhì)氨基酸代謝、次生代謝、脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄起始因子等功能組。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S792.95
【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

圖 2-1 三種提取銀杏葉片蛋白質(zhì)方法的凝膠圖譜（a-SDS-苯酚提取法；b- Tris-HCl 提取法；c-TCA/丙酮提取法）Fig. 2-1 The 2-DE profiles of proteins extracted by three methods2.3 討論2.3.1 蛋白質(zhì)濃度及含量雙向電泳中最重要的是樣品制備。生物樣品種類繁多，沒有標準的樣品的制備方但是還是能夠找到幾個基本的原則來指導雙向凝膠電泳的樣品制備，其中最關(guān)鍵的是品的濃度，任何生物樣品的制備，都無一例外要確定樣品溶液的濃度。一般，最理想樣品濃度是在 5~10μg/μL（靖長柏 2011），這個濃度時，考馬斯亮藍染色的上樣量 60的體積為 60~120μL。利用 Bradford 法測定比較三種提取方法所獲得的葉片蛋白質(zhì)的量，最終可溶性蛋白質(zhì)含量并沒有統(tǒng)計學差異。然而，當使用其他物種如軟橡木的葉織時，SDS-苯酚提取法（2.35mg/g 鮮重）比 TCA-丙酮得到更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量（0.46m鮮重）。TCA-丙酮與苯酚相比，在緩沖液中會存在有大量的難溶解的沉淀物，我們最回收的蛋白質(zhì)值在文獻報道的范圍內(nèi)（Carpentier et al. 2005）。Yeoh（Yeoh et al. 199等人在研究 90 株植物中的蛋白質(zhì)含量時發(fā)現(xiàn)，擬南芥的含量比菠菜低 6 倍。此外，

圖 3-1 不同樹齡銀杏葉組織生理指標（T1，T2 和 T3 分別代表 20±5，600±50 和 1200±100 年生銀杏）Fig. 3-1 The physiological indexes of Gingko leaves at different agesLeshem（1981）指出，葉片衰老最明顯的表現(xiàn)就是葉綠素逐漸消失，并伴隨以及葉片的最終脫落（李麗 2009）。許多研究表明，葉綠素含量和植物衰老之間顯的負相關(guān)（陳靠山等 1991; 戴金平等 1991），即衰老程度越嚴重，葉綠素含量如圖 3-1A 所示，葉綠素含量在 T1（幼齡）和 T2（中齡）間變化不顯著，然而在顯著降低，分別比 T1 和 T2 減少了 28.8%和 35.1%。如圖 3-1 B 為可溶性蛋白質(zhì)

【參考文獻】

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本文編號：2828200