【摘要】：C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子是植物中轉(zhuǎn)錄因子家族,參與植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)進(jìn)程,如調(diào)節(jié)植物器官生長(zhǎng)、促使毛狀體初始化、控制根的分生組織和葉片的極性等;同時(shí)參與植物的生物和非生物脅迫下逆境應(yīng)答反應(yīng),如低溫、干旱、高鹽及病原體防御等,在植物抗逆過程中發(fā)揮著重要作用。目前,木本植物中的相關(guān)C2H2型鋅指蛋白基因少有報(bào)道,本文對(duì)毛果楊中該家族的基因PtZFP103進(jìn)行初步的功能分析及逆境下其啟動(dòng)子的表達(dá)特性。結(jié)果如下:(1)對(duì)毛果楊根和葉在NaCl、mannitol、ABA、SA和MeJA處理下的不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和7d)表達(dá)模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)PtZFP103基因在各種脅迫下的表達(dá)量均有不同變化,其中在NaCl和干旱脅迫下基因在根和葉中的表達(dá)量提高較為顯著。從毛果楊中克隆出PtZFP103基因,對(duì)其核定位及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)進(jìn)行研究,研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞核中表達(dá),且其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)位于蛋白質(zhì)C端的379-507氨基酸區(qū)段。(2)利用PlantCare對(duì)PtZFP103基因啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域含有逆境脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats和ABA應(yīng)答元件ABRE等。構(gòu)建植物克隆載體pBI121-PtZFP103-GUS,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管通道法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。將轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行不同脅迫下GUS表達(dá)活性分析,發(fā)現(xiàn)其在NaCl、mannitol、ABA、SA和MeJA脅迫下GUS表現(xiàn)出較高的表達(dá)活性,且具有組織表達(dá)特異性。說明PtZFP103基因可能在逆境脅迫下參與脅迫響應(yīng)應(yīng)答。(3)將過表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花侵染法轉(zhuǎn)化到擬南芥中。通過在鹽和干旱脅迫條件下種子的萌發(fā)率和幼苗根長(zhǎng)鮮重的分析比較,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PtZFP103基因能夠提高擬南芥耐鹽抗旱能力。通過NBT、DAB、Evans Blue染色、MDA、SOD、POD各項(xiàng)生理指標(biāo)的觀察研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫條件下,PtZFP103基因的過表達(dá)擬南芥細(xì)胞受損程度明顯低于野生型擬南芥,SOD和POD活性明顯高于野生型。這些結(jié)果表明PtZFP103基因的過表達(dá)擬南芥可能啟動(dòng)了抗氧化酶酶促防御系統(tǒng)來提高耐鹽性。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S792.11
【圖文】：

圖２－１毛果楊基因戶／ＺＦＰ／０３與其他物種進(jìn)化樹的構(gòu)建逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＰｔＺＦＰ１０３邋ａｎｄ邋ｇｅｎｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑

逡逑圖２－３毛果楊ＲＮＡ條帶和ｃＤＮＡ檢測(cè)電泳圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｃＤＮＡ逡逑２、Ｐ／ＺＦＰ／ＯＪ基因的克隆逡逑將反轉(zhuǎn)錄成功的ｃＤＮＡ稀釋１０倍作為ＰＣＲ反應(yīng)模板。根據(jù)乃ＺＭ川Ｊ基因全逡逑長(zhǎng)序列所設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行目的條帶擴(kuò)增，長(zhǎng)度為５０７邋ｂｐ如圖２－４。將目的條帶擴(kuò)增逡逑后進(jìn)行膠回收，產(chǎn)物連接到ＰＭＤ１８－Ｔ載體，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液ＰＣＲ檢測(cè)，凝逡逑膠電泳檢測(cè)后觀察條帶是否正確如圖２－５，若大小與目的條帶相同則送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)逡逑果需與官網(wǎng)所查序列完全一致，說明克隆成功。逡逑Ｍ邋１邐１逡逑７５０邋ｂｐ邋一？邋Ｋ逡逑圖２－４八ＺＦＰ／Ｗ克隆產(chǎn)物逡逑Ｆｉｇ．邋２－４邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＰｔＺＦＰ１０３逡逑Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１：邋ＰｒＺＦＰｍ？克隆產(chǎn)物逡逑Ｍ邋１邐２逡逑ｍ逡逑７５０邋ｂｐ—邋■逡逑５００邋ｂｐ—ｆ逡逑圖邋２－５邋菌液邋ＰＣＲ邋檢測(cè)邋ｐＭＤ１８－Ｔ－邋ＡＺＦ／ＶＷ逡逑Ｆｉｇ．邋２－５邋Ｔｈｅ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｐＭＤ１８－Ｔ－邋ＰｔＺＦＰ１０３邋ｕｓｉｎｇ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１－２：含邋ＰＭＤ１８－Ｔ－Ｐ／２ＦＰ７０５邋大腸桿菌單菌落逡逑２．３．３過表達(dá)載體ｐＢＩ１２１－／Ｗ７＾－ＧＦＰ的構(gòu)建逡逑以ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｐ／ＺＦＰ／０Ｊ陽性質(zhì)粒為模板，酶切引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果逡逑如圖２－６所示�？闯觯担埃峰澹猓鹛幱忻髁恋膯我粭l帶

Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１：尸酶切引物邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物逡逑對(duì)膠回收產(chǎn)物和ｐＢＩ１２１－（＾ＦＰ質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切。將兩個(gè)酶切產(chǎn)物分別純化后連逡逑接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌。菌液ＰＣＲ結(jié)果如圖２－７所示，條帶與目的片段大小一致，亮逡逑度明顯大于Ｍａｋｅｒ，初步表明連接成功，同時(shí)選３個(gè)陽性克隆送公司測(cè)序。逡逑Ｍ邋１邐２邐３逡逑７５０邋ｂｐ—＾邐ｚ邋多邐，、逡逑５００邋ｂｐ邋—Ｉ逡逑圖邋２－７邋菌液邋ＰＣＲ邋檢測(cè)邋ＰＢＩ１２１－Ｐ⑵＾／０５－ＧＦＰ逡逑Ｆｉｇ．邋２－７邋Ｔｈｅ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｐＢ＼＼２＼－ＰｔＺＦＰ１０３－ＧＦＰ邋ｕｓｉｎｇ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡＭａｒｅｋｅｒＤＬ２０００；邋１－３：含邋ｐＢ１１２１－凡Ｚ仲７０３－ＧＦＰ邋大腸桿菌單菌落逡逑測(cè)序后的比對(duì)結(jié)果證明過表達(dá)載體ｐＢＩ１２１－竹ＺＦＰ川５－ＧＦＰ構(gòu)建成功，然后將其轉(zhuǎn)入逡逑農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５中，挑取單菌落后進(jìn)行菌液擴(kuò)增，用其質(zhì)粒為模板ＰＣＲ檢測(cè)，結(jié)果如逡逑圖邋２－８。逡逑Ｍ邋１邐２邐３逡逑７５０邋ｂｐ—邋＾逡逑５００邋ｂｐ—？邋Ｉ逡逑－１６－逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2758046