【摘要】：楊樹在生態(tài)防護上、環(huán)境美化上以及工業(yè)經(jīng)濟用途木材上有十分重要的作用,已成為世界上非常重要的人工林樹種之一�，F(xiàn)代分子生物技術(shù)的興起,為林木的遺傳改良提供了新的途徑。楊樹是根癌農(nóng)桿菌的天然寄主,并易于離體繁殖以及遺傳轉(zhuǎn)化,已成為研究多年生的植物生長和細胞組織結(jié)構(gòu)的重要模式植物。油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids,BRs)在植物的生長發(fā)育過程中不僅起著重要的作用,還具有多種生理功能,如促進細胞分裂和伸長、促進細胞再分化、延緩衰老以及提高植物抗逆性等等。油菜素內(nèi)酯在1982年被公認為繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸以及乙烯之后的第六大類植物激素。類固醇5α-還原酶基因(steroid 5α-reductase,DET2)屬于油菜素內(nèi)酯生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶基因,在植物正常生長發(fā)育中起著十分重要的作用。將來源于楊樹的Pt DET2基因?qū)煵莺兔讞钸M行遺傳轉(zhuǎn)化,取得了以下研究結(jié)果:1、植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得構(gòu)建了植物表達載體,以gus::nptⅡ融合基因作為篩選標記基因和報告基因,命名為p SH-35S-Pt DET2。將構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌株,并采用葉盤轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化煙草,經(jīng)篩選鑒定后統(tǒng)計獲得52株轉(zhuǎn)35S::Pt DET2基因煙草。2、超量表達Pt DET2基因?qū)煵萆L發(fā)育的影響研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)35S::Pt DET2基因煙草的韌皮部細胞層數(shù)分別是野生型煙草的2.28、2.83和2.89倍,觀察野生型煙草和轉(zhuǎn)Pt DET2基因煙草莖的髓細胞時發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草的髓細胞長度大于野生型煙草。Pt DET2基因可以促進側(cè)根、下胚軸、根毛和不定根的生長發(fā)育。分析BRs與其他激素之間的關(guān)系,結(jié)果表明:IAA與BRs在對煙草下胚軸生長上是相互獨立的,在根的生長方面是相互拮抗的;IBA與BRs在煙草下胚軸生長上是相互拮抗的,在根生長方面相互獨立;KT與BRs對煙草下胚軸的生長相互拮抗,對根的生長方面具有獨立作用;GAs與BRs在煙草下胚軸生長方面有拮抗作用,在根生長方面存在協(xié)同作用;ABA與BRs在煙草下胚軸方面相互獨立,在根生長方面相互拮抗。3、轉(zhuǎn)Pt DET2基因煙草抗旱性分析選取3個不同株系TP10、TP12和TP15,在不同濃度甘露醇下模擬干旱脅迫,對種子發(fā)芽率和幼苗期進行抗旱性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用300mmol/L甘露醇處理15 d,種子發(fā)芽率比野生型高40%以上,從苗期根的生長發(fā)現(xiàn),野生型植株根的生長明顯受到抑制;分別用20%PEG 6000處理轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株0、1、3、5和7 d,結(jié)果顯示,在干旱脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草的超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性和過氧化物酶的活性均顯著高于野生型,而丙二醛的含量則顯著低于野生型煙草。結(jié)果表明,超量表達Pt DET2基因可以增強煙草的抗旱性。4、轉(zhuǎn)Pt DET2基因煙草抗鹽性分析選取3個不同株系TP10、TP12和TP15,在不同濃度Na Cl下模擬鹽脅迫,對種子的發(fā)芽率和幼苗期進行抗鹽性分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草種子在200mmol/L Na Cl處理下15 d后,發(fā)芽率比野生型高50%以上,而野生型煙草根的生長明顯受到抑制。分別用200mmol/L Na Cl處理轉(zhuǎn)基因和野生型植株0、1、3、5和7 d后,轉(zhuǎn)Pt DET2基因煙草的超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性和過氧化物酶的活性均高于野生型,而丙二醛的含量則顯著低于野生型煙草。結(jié)果表明,超量表達Pt DET2基因可以增強煙草的抗鹽性。5、毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化用攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進行目的基因的轉(zhuǎn)化,經(jīng)GUS組織化學染色及PCR擴增,其中3株GUS染色為陽性并擴增出目的條帶,說明Pt DET2基因已經(jīng)整合到了楊樹的基因組中。6、超量表達Pt DET2基因?qū)γ讞罹S管束發(fā)育的影響研究發(fā)現(xiàn),超量表達Pt DET2基因可以提高毛白楊木質(zhì)部的厚度,增加木射線細胞與木纖維細胞層數(shù),且細胞體積變大,數(shù)目增多。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S792.117
【圖文】：

特別是油菜（Brassicanapus L.）的花粉提取物，能夠強烈地刺激菜因此，這種花粉提取物被命名為油菜素（Brassins）。用高濃度油菜發(fā)現(xiàn)菜豆第二節(jié)斷裂，再重新生長在一起，赤霉素（Gibberellin, 導伸長，但與此不同（Mitchell et al., 1970）。這種提取物是混合物中的“活性因子”，1974 年以來，由美國農(nóng)業(yè)部啟動，貝爾茲維爾農(nóng)ReltsvileAgriculturalResearchCenter,BARC）、美國北區(qū)研究中心（Nal Research Center, NRRC）和東區(qū)研究中心（Eastern Regional , ERRC）參與協(xié)作公關(guān)項目（Rao et al., 2002）。1970 年，Grove 等斤的油菜花粉，最終得到了 10mg 結(jié)晶，經(jīng)過 X-射線超微量分析，結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)屬于一種甾體類物質(zhì)，并命名為油菜素內(nèi)酯（Brassinoli內(nèi)酯的分子式為 C28H48O6（圖 1.1），是一種 28 碳化合物，分子量為 274-275℃，化學名稱為 2α，3α，22α，23α-4 羥-24α-甲基-β-同型--6-酮（Grove et al.,1979）。

4 -過程就是油菜素內(nèi)酯特異合成途徑（Sakurai et al., 1997）。(1) 早期 C-6 氧化途徑早期 C-6 氧化途徑中油菜素內(nèi)酯合成的從油菜甾醇（campesterol）開始（圖1.3），經(jīng)過加氧、6-羥化以及氧化得到了 6-氧油菜甾烷醇（6-oxocampestanol），經(jīng)羥化后得到茶甾酮（teasterone），以及脫羥基和再羥化得到香蒲甾醇（typhasterol），再經(jīng)過一系列的反應最終合成油菜素內(nèi)酯， 此生物合成途徑即為早期 C-6 氧化途徑（Suzuki et al., 1995;Fujioka et al., 1995;Suzuki et al.,1994;Clouse et al., 1998）。BRs 早期 C-6 氧化途徑在許多種植物中存在，比如：長春花、擬南芥、煙草等，說明早期此途徑廣泛存在植物中（Noguchietal.,2000）。圖 1.3 油菜素類固醇的生物合成途徑（Fujioka and Yokota,2003）Figure 1.3 The BR biosynthesis pathway(Fujioka and Yokota,2003)（2）晚期 C-6 氧化途徑晚期 C-6 氧化途徑，也被稱為后期 C-6 氧化途徑，是一些植物中廣泛存在的另一條油菜素內(nèi)酯合成途徑。6-脫氧茶甾酮（6-deoxoteasterone）、6-脫氧香蒲甾醇（6-deoxotyphasterol）等 6-脫氧 BRs 以前被認為不具有生物活性或者活性很低

T2 植物表達載體。gus::nptII:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和35S:來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；Po號。 plant expression vector pSH-35S-DET2. gus::nptII: fusioferase gene and β-glucuronidase gene; 35S: plant constitucauliflower mosaic virus; PolyA: PolyA terminal sequen導的煙草遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株獲得穩(wěn)定后，對抗性煙草和野生型煙草的葉片進行色呈陽性的植株提取 DNA 進行 PCR 檢測，野生，抗性植株中獲得了目的條帶。證明外源 PtDE組中，獲得了 52 株轉(zhuǎn) 35S::DET2 基因煙草（圖

【參考文獻】

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