【摘要】：松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus)是一世界性的檢疫性病害,已經(jīng)對我國造成了巨大的經(jīng)濟、生態(tài)損失,嚴(yán)重影響森林健康和生態(tài)安全。cry5Ba3Φ是本實驗室從蘇云金芽孢桿菌zjfc85上克隆得到的毒蛋白基因經(jīng)密碼子改造而來,其編碼的毒蛋白對松材線蟲毒殺活性已被證實。為進一步明確該殺蟲蛋白結(jié)構(gòu)與毒力功能的關(guān)系,本研究設(shè)計Cry5Ba3Φ蛋白結(jié)構(gòu)突變?nèi)毕菪娃D(zhuǎn)灰葡萄孢菌株,并測試其毒殺活性變化。為探索長期接觸Cry5Ba3Φ蛋白是否會使松材線蟲產(chǎn)生毒力適應(yīng)性表型及與線蟲伴生細菌菌群間潛在的關(guān)聯(lián),本研究觀察隨毒蛋白接觸時間和接觸頻次松材線蟲的種群密度變化情況,并分析適應(yīng)Cry5Ba3Φ蛋白前后松材線蟲體內(nèi)和體外的伴生細菌菌群結(jié)構(gòu)。主要結(jié)果如下:1.利用生物信息學(xué)軟件進行Cry5Ba3Φ毒蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析,在保留其毒性中心區(qū)的基礎(chǔ)上破壞其完整性結(jié)構(gòu),選擇了五處氨基酸位點進行截短,得到六條不同長度的cry5Ba3Φ基因片段。利用Gibson技術(shù)將這些基因片段裝載到pTFCM載體上,再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,將cry5Ba3Φ缺失片段整合至灰葡萄孢菌的基因組中。生測實驗表明,破壞Cry5Ba3Φ蛋白的不同區(qū)域結(jié)構(gòu)會對其作用松材線蟲的毒力造成不同程度影響。2.相比于野生型灰葡萄孢菌,用轉(zhuǎn)cryBa3Φ基因灰葡萄孢菌飼喂的松材線蟲其種群繁殖受到明顯抑制,但是隨著接觸時間延長或者接觸頻次增加,松材線蟲種群密度開始回升且與相應(yīng)野生型灰葡萄孢菌上線蟲的種群密度無明顯差異。運用變性梯度凝膠電泳方法(DGGE)檢測野生型和轉(zhuǎn)cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢菌上連續(xù)轉(zhuǎn)板培養(yǎng)線蟲的伴生細菌菌群群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)松材線蟲體內(nèi)和體外的伴生細菌菌群結(jié)構(gòu)變化與線蟲對Cry5Ba3Φ的適應(yīng)能力間呈現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性。本研究初步探索了Cry5Ba3Φ結(jié)構(gòu)完整性對毒力的影響以及松材線蟲伴生細菌菌群變化與線蟲適應(yīng)Cry5Ba3Φ毒殺活性之間的潛在關(guān)聯(lián),為下一步明確線蟲伴生細菌在毒蛋白適應(yīng)能力形成過程中的調(diào)控功能以及伴生細菌作用于毒蛋白的潛在方式奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S763.18
【圖文】：

[115]，從而達到不同DNA雙鏈分開的分離目的(圖1-1)。技術(shù)最初是被研究人員應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，他們利用DGGE技術(shù)檢測基因的突變[116]。Muyzer等首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的研究。并證4.5 PCR-RFLP 技術(shù)

Cry5Ba3Φ結(jié)構(gòu)完整性與毒力關(guān)系及松材線蟲伴生細菌介導(dǎo)的毒蛋白適應(yīng)性初探endotoxin。其中，Cry5Ba3Φ的 endotoxin-N 由 7 個疏水的α螺旋形成（aa 115-161，175-177，187-211，222-256，262-290，299-315，321-326）。圖 2-1 Cry5Ba3Φ功能結(jié)構(gòu)Fig. 2-1 Construction of protein Cry5Ba3Φ使用 SMART 進行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)在 N 端（aa 202-327）和 C 端（aa 561-697）位置各含有一個 endotoxin。

23Fig. 2-4 PCR product by agarose gel electrophor（M：DNAmaker ； 1-3：pTFCM-TRP vector bacbo

【參考文獻】

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本文編號：2754615