發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 04:16

【摘要】：SPL是植物特異性的轉(zhuǎn)錄因子家族,通過調(diào)節(jié)各種生理生化過程在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建白樺BpSPL9基因的植物抑制表達(dá)載體和miR156的過表達(dá)載體,進(jìn)行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化,對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型觀測(cè),并驗(yàn)證白樺miR156和BpSPL9基因的功能及調(diào)控關(guān)系。主要研究包括:1.應(yīng)用Gateway的方法構(gòu)建白樺BpSPL9的植物抑制表達(dá)載體,采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的合子胚法進(jìn)行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化,通過PCR和定量PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果表明,白樺BpSPL9基因已經(jīng)成功整合到了植物的基因組上。通過對(duì)BpSPL9抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺株系進(jìn)行表型觀測(cè),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系苗高比對(duì)照植株的苗高低30.34%,地徑低6.24%,單株葉片數(shù)量少于26.03%,第七八片葉葉面積分別低于42.87%和50.91%,葉片長(zhǎng)寬比低于27.21%和27.99%,葉間距主要分布在8-14 mm之間,而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑墓?jié)間距分布在10-14 mm之間。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行激素含量測(cè)定,結(jié)果表明:GA3、IAA及6-BA含量較非轉(zhuǎn)基因植株含量降低。2.應(yīng)用Gateway技術(shù)構(gòu)建白樺miR156的植物過表達(dá)載體,采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的合子胚法進(jìn)行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化,通過PCR和定量PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果表明,白樺miR156已經(jīng)成功整合到了植物的基因組上。并且轉(zhuǎn)基因植株的miR556表達(dá)量高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍Ｍㄟ^對(duì)轉(zhuǎn)miR156白樺株系進(jìn)行表型觀察,發(fā)現(xiàn)其苗高比對(duì)照植株的苗高39.88%,地徑高18.41%,單株葉片數(shù)量多于46.74%,第七、八片葉葉面積分別低于58.92%和75.60%,葉片長(zhǎng)寬比高于4.47%和4.53%,葉間距主要位于6-8 mm,而對(duì)照植株的節(jié)間距主要位于10-14 mm,節(jié)間距比對(duì)照植株短。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行激素含量測(cè)定,結(jié)果表明:GA3、IAA、BR及6-BA含量較非轉(zhuǎn)基因植株含量增加,葉綠素含量及花青素含量也都有明顯增加。白樺12條SPL基因家族中7條有microRNA156識(shí)別位點(diǎn),通過對(duì)miR156過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的定量分析,選取表達(dá)量較高的2個(gè)號(hào)的cDNA為模板,對(duì)7條SPL基因進(jìn)行定量分析,定量PCR結(jié)果表明:BpSPL5、BpSPL8、BpSPL9、BpSPL11、BpSPL12基因表達(dá)量有所下降,表明這5條基因受miR156的調(diào)控,miR156和BpSPL9基因呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控的關(guān)系。 【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S792.153

【圖文】：

以多年生的白樺的葉片ｃＤＮＡ為模板，根據(jù)白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的辦５／１９全長(zhǎng)，逡逑設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于０．８％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯逡逑示在１１７６ｂｐ處獲得特異條帶，，與目標(biāo)大小一致（見圖２－１）。逡逑Ｔｕｎｖ邋Ｉ逡逑５＊０１＾邋＿壚（、：５．、：：：＿＿：丨．４：呡賽—Ｊｊ逡逑２３＜？ｒ邐；逡逑圖２－１基因ＰＣＲ產(chǎn)物電泳圖譜逡逑Ｍ．邋ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００；邋１．水對(duì)照；２．邋尸基因逡逑－１０－逡逑

ＴＯＰＯ反應(yīng)液轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，涂在篩選（卡那霉素）平板中，３７邋°Ｃ過夜，隨機(jī)挑逡逑取單克隆進(jìn)行菌液ＰＣＲ檢測(cè)。結(jié)果顯示，挑取的６個(gè)單克隆中３個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性，目的逡逑基因辦兌Ｚ９抑制表達(dá)基因已經(jīng)整合到了邋ＴＯＰＯ載體上，如圖２－２。逡逑■＾＾＾；縫＿：栜‘戮後象囊灥１＿：黎？

本文編號(hào)：2712261