【摘要】：香樟(Cinnamomum camphora L.)具有較高的觀賞價值、實用價值和文化價值,然而香樟樹作為亞熱帶樹種,其對低溫的適應能力較差。提高香樟的抗寒性不僅可豐富我國北方地區(qū)風景樹種,使其更好的發(fā)揮園林綠化價值,而且可使其更加健壯的生長減少經(jīng)濟損失,有利于香樟更好的發(fā)揮經(jīng)濟樹種的優(yōu)勢。提高香樟抗寒性最有效的方法是選育抗寒新品種,而抗寒基因的挖掘是抗寒育種的關(guān)鍵,本實驗室前期已從香樟中分離獲得4個抗寒相關(guān)CcCBF基因,欲在香樟中研究CcCBFs基因功能,然而,由于木本植物本身的特殊性,使其遺傳轉(zhuǎn)化和再生周期較長,通過獲得轉(zhuǎn)基因香樟植株研究CcCBFs基因功能不切實際。因此,發(fā)掘快速準確基因功能研究材料,具有重要意義。香樟胚性愈傷組織質(zhì)地堅實,呈嫩黃色球形顆粒狀,由等直徑細胞組成,其原生質(zhì)濃厚分裂活性較強,且具備胚胎發(fā)生能力,可形成體細胞胚。早期研究發(fā)現(xiàn),以香樟胚性愈傷組織作為受體,能獲得較理想的轉(zhuǎn)化效果。因此,香樟胚性愈傷組織可能是基因功能驗證的好材料。本研究首先利用組培技術(shù),優(yōu)化香樟胚性愈傷組織誘導、增殖體系;然后,以香樟胚性愈傷組織為試材,從分子和組織水平綜合分析其感知低溫脅迫能力,篩選獲得其受低溫脅迫最強烈的時刻和生理指標,從而建立香樟胚性愈傷組織抗寒性鑒定體系,以期后續(xù)用于鑒別不同轉(zhuǎn)基因材料的抗寒性。本研究主要成果如下:1.香樟胚性愈傷組織誘導、增殖體系的優(yōu)化香樟體胚的誘導獲得:以香樟未成熟果實為外植體,探究外植體消毒方法、外植體采樣時期、植物生長調(diào)節(jié)劑組合及水解酪蛋白濃度,對香樟體胚誘導效果的影響。結(jié)果顯示,1%次氯酸鈉消毒處理25 min時消毒效果較為理想;7月下旬收獲的新鮮外植體體胚誘導率,高于8月上旬與8月中旬體胚誘導率;植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA與2,4-D的合理添加(1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D),有利于香樟體胚的誘導獲得;水解酪蛋白的添加對香樟體胚的誘導發(fā)生具有促進作用,當水解酪蛋白濃度為750 mg/L時,其體胚誘導率相對較高。本研究獲得的較適宜誘導配方為D4:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖+750 mg/L水解酪蛋白,其體胚誘導率為63.3%。香樟體胚的增殖:將誘導獲得的香樟體胚,及時更換至新鮮培養(yǎng)皿D4中(每2周繼代保存一次),可保持較高的增殖效率,且增殖獲得的體胚具有較強的活力。本研究共篩選獲得3個香樟體胚無性系,分別命名為SE1、SE3和SE5。香樟胚性愈傷組織的誘導獲得:以增殖獲得的具有相同激素來源的香樟體胚SE3無性系為試材,探究植物生長調(diào)節(jié)劑組合及蔗糖濃度,對香樟胚性愈傷組織誘導效果的影響。結(jié)果顯示,當2,4-D與6-BA比值為8(4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)時,胚性愈傷組織的誘導率相對較高為18.3%,其次為2,4-D與6-BA比值為12(6.0mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)時,誘導率為13.3%;當蔗糖濃度為5%時,胚性愈傷組織誘導率為28.3%,且誘導獲得的胚性愈傷組織活力較強,呈嫩黃色緊致狀。可知,2,4-D在香樟胚性愈傷組織的誘導過程中起主導作用,適宜的蔗糖濃度有利于胚性愈傷組織狀態(tài)的調(diào)整,本研究中較適宜的胚性愈傷組織誘導配方為F3:MS+0.5mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L Vc+0.8%瓊脂+5%蔗糖+1000 mg/L水解酪蛋白,誘導率為28.3%。香樟胚性愈傷組織的增殖:以誘導獲得的胚性愈傷組織為試材,探究植物生長調(diào)節(jié)劑組合、水解酪蛋白濃度及繼代頻率,對香樟胚性愈傷組織增殖效果的影響。結(jié)果顯示,隨著6-BA和2,4-D質(zhì)量濃度的增加,香樟胚性愈傷組織增殖率呈現(xiàn)先增后減的趨勢,植物生長調(diào)節(jié)劑在1.5 mg/L 6-BA與0.15 mg/L 2,4-D濃度組合時,出現(xiàn)峰值,此時的胚性愈傷組織的增殖率相對較高;水解酪蛋白的添加有利用香樟胚性愈傷組織的增殖;適當提高繼代頻率有利于香樟胚性愈傷組織的保存與增殖,每7天繼代一次其活力和增殖能力均較強。本研究獲得的較適宜增殖配方為J5:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖+1000 mg/L水解酪蛋白;繼代頻率為:每7天更換繼代培養(yǎng)皿一次。此外,本研究共篩選獲得4個香樟胚性愈傷組織無性系,分別命名為EC1、EC3、EC5和EC8。2.香樟胚性愈傷組織抗寒性鑒定體系的建立以香樟胚性愈傷組織EC5無性系為試材,采用熒光定量PCR技術(shù),分析CcCBFs在4℃低溫脅迫下的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):脅迫處理1 h時CcCBFs相對表達量均顯著高于對照(0 h),隨脅迫時間延長CcCBFs相對表達量呈先升后降的趨勢,且在脅迫處理24 h其相對表達量極顯著增加達到峰值。以香樟胚性愈傷組織EC5無性系為試材,探究其在4℃低溫脅迫下的生理、生化指標變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脯氨酸和可溶性糖含量均隨脅迫時間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理8 h和2 h出現(xiàn)峰值;丙二醛含量隨脅迫時長的增加,呈先降低后升高的趨勢,于脅迫12 h出現(xiàn)低峰;SOD和CAT活力均隨脅迫時間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理12 h和8 h出現(xiàn)峰值。結(jié)果表明,香樟胚性愈傷組織在經(jīng)受4℃低溫脅迫后,其生理、生化指標能夠呈現(xiàn)一定變化趨勢,因此該材料可在細胞水平上感知4℃低溫脅迫。以香樟胚性愈傷組織EC5無性系為試材,探究其在-4℃低溫脅迫下的生理、生化指標變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脯氨酸和可溶性糖含量均隨脅迫時間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理8 h和2 h出現(xiàn)峰值;丙二醛含量隨脅迫時長的增加,呈先降低后升高的趨勢,于脅迫2 h出現(xiàn)低峰;CAT和POD活力均隨脅迫時間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理8 h和2 h出現(xiàn)峰值。結(jié)果表明,香樟胚性愈傷組織在經(jīng)受-4℃低溫脅迫后,其生理、生化指標能夠呈現(xiàn)一定變化趨勢,因此該材料可在細胞水平上感知-4℃低溫脅迫。本研究建立香樟胚性愈傷組織抗寒性評價方法,當脯氨酸、可溶性糖含量相對較高,SOD、CAT和POD活力相對較強,MDA含量相對較低時,則對應的香樟胚性愈傷組織的抗寒性相對較強;反之,則相對較弱。本研究不僅證實了胚性愈傷組織可以作為鑒定香樟抗寒性的良好材料,而且揭示了香樟胚性愈傷組織在低溫脅迫下CcCBFs表達模式以及各生理、生化指標變化規(guī)律,篩選獲得該材料響應低溫脅迫較敏感的生理指標和最劇烈的時刻。4℃下篩選獲得的抗寒性鑒定指標主要包括:可溶性糖、脯氨酸、SOD、丙二醛和CAT,其對應的具有研究價值的時刻分別為:2 h、8 h、8 h、12 h、12 h。-4℃下篩選獲得的抗寒性鑒定指標主要包括:可溶性糖、丙二醛、POD、脯氨酸和CAT,其對應的具有研究價值的時刻分別為:2 h、2 h、2 h、8 h、8 h。
【圖文】：

其體胚誘導率均大于 60%，表明此濃度范圍有利于香樟未成熟合子胚誘導獲得體胚（如圖3-1 所示）。表 3-4 不同水解酪蛋白濃度對香樟未成熟合子胚誘導體胚的影響Table 3-4 Effects of different hydrolyzed casein concentrations on somatic embryos induced byimmature zygotic embryos of C. camphora試驗編號外植體數(shù)量（個）CH（mg/L）體胚誘導率（%）D 1 60 0 48.3D 2 60 250 53.3D 3 60 500 60D 4 60 750 63.3D 5 60 1000 61.7D 6 60 1250 58.3D 7 60 1500 58.3D 8 60 1750 55D 9 60 2000 56.73.1.5 小結(jié)香樟體胚的誘導試驗結(jié)果表明，外植體消毒方式、外植體采樣時期、植物生長調(diào)節(jié)劑組合以及水解酪蛋白濃度，均影響香樟未成熟合子胚誘導體胚的效果。分析研究結(jié)果可知：1%的 NaClO 較適合作為香樟未成熟果實的表面消毒劑，，消毒處理25 min 時消毒效果較為理想；7 月下旬為香樟體胚誘導試驗的適宜取樣時間段，此時間段采摘的香樟未成熟果實較易誘導獲得體胚；復合配方 MBD 的誘導效果相對較好；當水解酪蛋白濃度為 750 mg/L 時，其體胚誘導率相對較高。綜合分析可知

圖 3-1 香樟體胚的誘導獲得1.香樟未成熟果實；2.香樟未成熟合子胚；3.誘導獲得的體胚Fig 3-1 Somatic embryos induced by immature zygotic embryos of C. camphora1. Immature fruit; 2. Immature zygotic embryo; 3. Somatic embryo..2 香樟體胚的增殖將上述研究中誘導獲得的香樟體胚，置于增殖培養(yǎng)皿 D4（MS+1.0 mg/L 6-BA+.1 mg/L 2,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖+750 mg/L 水解酪蛋白）中，暗培養(yǎng) 1 周后即可察到體胚體積膨大，2～3 周后可觀察到體胚大量增殖的現(xiàn)象，同時在增殖培養(yǎng)過中可觀察到部分體胚萌發(fā)的現(xiàn)象（圖 3-2 所示）。
【學位授予單位】：南陽師范學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S792.23

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