發(fā)布時(shí)間：2020-05-01 19:54

【摘要】：香樟(Cinnamomum camphora L.)具有較高的觀賞價(jià)值、實(shí)用價(jià)值和文化價(jià)值,然而香樟樹作為亞熱帶樹種,其對(duì)低溫的適應(yīng)能力較差。提高香樟的抗寒性不僅可豐富我國北方地區(qū)風(fēng)景樹種,使其更好的發(fā)揮園林綠化價(jià)值,而且可使其更加健壯的生長減少經(jīng)濟(jì)損失,有利于香樟更好的發(fā)揮經(jīng)濟(jì)樹種的優(yōu)勢。提高香樟抗寒性最有效的方法是選育抗寒新品種,而抗寒基因的挖掘是抗寒育種的關(guān)鍵,本實(shí)驗(yàn)室前期已從香樟中分離獲得4個(gè)抗寒相關(guān)CcCBF基因,欲在香樟中研究CcCBFs基因功能,然而,由于木本植物本身的特殊性,使其遺傳轉(zhuǎn)化和再生周期較長,通過獲得轉(zhuǎn)基因香樟植株研究CcCBFs基因功能不切實(shí)際。因此,發(fā)掘快速準(zhǔn)確基因功能研究材料,具有重要意義。香樟胚性愈傷組織質(zhì)地堅(jiān)實(shí),呈嫩黃色球形顆粒狀,由等直徑細(xì)胞組成,其原生質(zhì)濃厚分裂活性較強(qiáng),且具備胚胎發(fā)生能力,可形成體細(xì)胞胚。早期研究發(fā)現(xiàn),以香樟胚性愈傷組織作為受體,能獲得較理想的轉(zhuǎn)化效果。因此,香樟胚性愈傷組織可能是基因功能驗(yàn)證的好材料。本研究首先利用組培技術(shù),優(yōu)化香樟胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖體系;然后,以香樟胚性愈傷組織為試材,從分子和組織水平綜合分析其感知低溫脅迫能力,篩選獲得其受低溫脅迫最強(qiáng)烈的時(shí)刻和生理指標(biāo),從而建立香樟胚性愈傷組織抗寒性鑒定體系,以期后續(xù)用于鑒別不同轉(zhuǎn)基因材料的抗寒性。本研究主要成果如下:1.香樟胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖體系的優(yōu)化香樟體胚的誘導(dǎo)獲得:以香樟未成熟果實(shí)為外植體,探究外植體消毒方法、外植體采樣時(shí)期、植物生長調(diào)節(jié)劑組合及水解酪蛋白濃度,對(duì)香樟體胚誘導(dǎo)效果的影響。結(jié)果顯示,1%次氯酸鈉消毒處理25 min時(shí)消毒效果較為理想;7月下旬收獲的新鮮外植體體胚誘導(dǎo)率,高于8月上旬與8月中旬體胚誘導(dǎo)率;植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA與2,4-D的合理添加(1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D),有利于香樟體胚的誘導(dǎo)獲得;水解酪蛋白的添加對(duì)香樟體胚的誘導(dǎo)發(fā)生具有促進(jìn)作用,當(dāng)水解酪蛋白濃度為750 mg/L時(shí),其體胚誘導(dǎo)率相對(duì)較高。本研究獲得的較適宜誘導(dǎo)配方為D4:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖+750 mg/L水解酪蛋白,其體胚誘導(dǎo)率為63.3%。香樟體胚的增殖:將誘導(dǎo)獲得的香樟體胚,及時(shí)更換至新鮮培養(yǎng)皿D4中(每2周繼代保存一次),可保持較高的增殖效率,且增殖獲得的體胚具有較強(qiáng)的活力。本研究共篩選獲得3個(gè)香樟體胚無性系,分別命名為SE1、SE3和SE5。香樟胚性愈傷組織的誘導(dǎo)獲得:以增殖獲得的具有相同激素來源的香樟體胚SE3無性系為試材,探究植物生長調(diào)節(jié)劑組合及蔗糖濃度,對(duì)香樟胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)2,4-D與6-BA比值為8(4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)時(shí),胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率相對(duì)較高為18.3%,其次為2,4-D與6-BA比值為12(6.0mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA)時(shí),誘導(dǎo)率為13.3%;當(dāng)蔗糖濃度為5%時(shí),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為28.3%,且誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織活力較強(qiáng),呈嫩黃色緊致狀�？芍�,2,4-D在香樟胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程中起主導(dǎo)作用,適宜的蔗糖濃度有利于胚性愈傷組織狀態(tài)的調(diào)整,本研究中較適宜的胚性愈傷組織誘導(dǎo)配方為F3:MS+0.5mg/L 6-BA+4.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L Vc+0.8%瓊脂+5%蔗糖+1000 mg/L水解酪蛋白,誘導(dǎo)率為28.3%。香樟胚性愈傷組織的增殖:以誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織為試材,探究植物生長調(diào)節(jié)劑組合、水解酪蛋白濃度及繼代頻率,對(duì)香樟胚性愈傷組織增殖效果的影響。結(jié)果顯示,隨著6-BA和2,4-D質(zhì)量濃度的增加,香樟胚性愈傷組織增殖率呈現(xiàn)先增后減的趨勢,植物生長調(diào)節(jié)劑在1.5 mg/L 6-BA與0.15 mg/L 2,4-D濃度組合時(shí),出現(xiàn)峰值,此時(shí)的胚性愈傷組織的增殖率相對(duì)較高;水解酪蛋白的添加有利用香樟胚性愈傷組織的增殖;適當(dāng)提高繼代頻率有利于香樟胚性愈傷組織的保存與增殖,每7天繼代一次其活力和增殖能力均較強(qiáng)。本研究獲得的較適宜增殖配方為J5:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L 2,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖+1000 mg/L水解酪蛋白;繼代頻率為:每7天更換繼代培養(yǎng)皿一次。此外,本研究共篩選獲得4個(gè)香樟胚性愈傷組織無性系,分別命名為EC1、EC3、EC5和EC8。2.香樟胚性愈傷組織抗寒性鑒定體系的建立以香樟胚性愈傷組織EC5無性系為試材,采用熒光定量PCR技術(shù),分析CcCBFs在4℃低溫脅迫下的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):脅迫處理1 h時(shí)CcCBFs相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(0 h),隨脅迫時(shí)間延長CcCBFs相對(duì)表達(dá)量呈先升后降的趨勢,且在脅迫處理24 h其相對(duì)表達(dá)量極顯著增加達(dá)到峰值。以香樟胚性愈傷組織EC5無性系為試材,探究其在4℃低溫脅迫下的生理、生化指標(biāo)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脯氨酸和可溶性糖含量均隨脅迫時(shí)間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理8 h和2 h出現(xiàn)峰值;丙二醛含量隨脅迫時(shí)長的增加,呈先降低后升高的趨勢,于脅迫12 h出現(xiàn)低峰;SOD和CAT活力均隨脅迫時(shí)間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理12 h和8 h出現(xiàn)峰值。結(jié)果表明,香樟胚性愈傷組織在經(jīng)受4℃低溫脅迫后,其生理、生化指標(biāo)能夠呈現(xiàn)一定變化趨勢,因此該材料可在細(xì)胞水平上感知4℃低溫脅迫。以香樟胚性愈傷組織EC5無性系為試材,探究其在-4℃低溫脅迫下的生理、生化指標(biāo)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脯氨酸和可溶性糖含量均隨脅迫時(shí)間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理8 h和2 h出現(xiàn)峰值;丙二醛含量隨脅迫時(shí)長的增加,呈先降低后升高的趨勢,于脅迫2 h出現(xiàn)低峰;CAT和POD活力均隨脅迫時(shí)間的延長,呈先升后降的趨勢,分別于脅迫處理8 h和2 h出現(xiàn)峰值。結(jié)果表明,香樟胚性愈傷組織在經(jīng)受-4℃低溫脅迫后,其生理、生化指標(biāo)能夠呈現(xiàn)一定變化趨勢,因此該材料可在細(xì)胞水平上感知-4℃低溫脅迫。本研究建立香樟胚性愈傷組織抗寒性評(píng)價(jià)方法,當(dāng)脯氨酸、可溶性糖含量相對(duì)較高,SOD、CAT和POD活力相對(duì)較強(qiáng),MDA含量相對(duì)較低時(shí),則對(duì)應(yīng)的香樟胚性愈傷組織的抗寒性相對(duì)較強(qiáng);反之,則相對(duì)較弱。本研究不僅證實(shí)了胚性愈傷組織可以作為鑒定香樟抗寒性的良好材料,而且揭示了香樟胚性愈傷組織在低溫脅迫下CcCBFs表達(dá)模式以及各生理、生化指標(biāo)變化規(guī)律,篩選獲得該材料響應(yīng)低溫脅迫較敏感的生理指標(biāo)和最劇烈的時(shí)刻。4℃下篩選獲得的抗寒性鑒定指標(biāo)主要包括:可溶性糖、脯氨酸、SOD、丙二醛和CAT,其對(duì)應(yīng)的具有研究價(jià)值的時(shí)刻分別為:2 h、8 h、8 h、12 h、12 h。-4℃下篩選獲得的抗寒性鑒定指標(biāo)主要包括:可溶性糖、丙二醛、POD、脯氨酸和CAT,其對(duì)應(yīng)的具有研究價(jià)值的時(shí)刻分別為:2 h、2 h、2 h、8 h、8 h。
【圖文】：

其體胚誘導(dǎo)率均大于 60%，表明此濃度范圍有利于香樟未成熟合子胚誘導(dǎo)獲得體胚（如圖3-1 所示）。表 3-4 不同水解酪蛋白濃度對(duì)香樟未成熟合子胚誘導(dǎo)體胚的影響Table 3-4 Effects of different hydrolyzed casein concentrations on somatic embryos induced byimmature zygotic embryos of C. camphora試驗(yàn)編號(hào)外植體數(shù)量（個(gè)）CH（mg/L）體胚誘導(dǎo)率（%）D 1 60 0 48.3D 2 60 250 53.3D 3 60 500 60D 4 60 750 63.3D 5 60 1000 61.7D 6 60 1250 58.3D 7 60 1500 58.3D 8 60 1750 55D 9 60 2000 56.73.1.5 小結(jié)香樟體胚的誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體消毒方式、外植體采樣時(shí)期、植物生長調(diào)節(jié)劑組合以及水解酪蛋白濃度，均影響香樟未成熟合子胚誘導(dǎo)體胚的效果。分析研究結(jié)果可知：1%的 NaClO 較適合作為香樟未成熟果實(shí)的表面消毒劑，，消毒處理25 min 時(shí)消毒效果較為理想；7 月下旬為香樟體胚誘導(dǎo)試驗(yàn)的適宜取樣時(shí)間段，此時(shí)間段采摘的香樟未成熟果實(shí)較易誘導(dǎo)獲得體胚；復(fù)合配方 MBD 的誘導(dǎo)效果相對(duì)較好；當(dāng)水解酪蛋白濃度為 750 mg/L 時(shí)，其體胚誘導(dǎo)率相對(duì)較高。綜合分析可知

圖 3-1 香樟體胚的誘導(dǎo)獲得1.香樟未成熟果實(shí)；2.香樟未成熟合子胚；3.誘導(dǎo)獲得的體胚Fig 3-1 Somatic embryos induced by immature zygotic embryos of C. camphora1. Immature fruit; 2. Immature zygotic embryo; 3. Somatic embryo..2 香樟體胚的增殖將上述研究中誘導(dǎo)獲得的香樟體胚，置于增殖培養(yǎng)皿 D4（MS+1.0 mg/L 6-BA+.1 mg/L 2,4-D+0.8%瓊脂+3%蔗糖+750 mg/L 水解酪蛋白）中，暗培養(yǎng) 1 周后即可察到體胚體積膨大，2～3 周后可觀察到體胚大量增殖的現(xiàn)象，同時(shí)在增殖培養(yǎng)過中可觀察到部分體胚萌發(fā)的現(xiàn)象（圖 3-2 所示）。
【學(xué)位授予單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S792.23

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本文編號(hào)：2647000