發(fā)布時間：2020-04-18 00:21

【摘要】：SOS(Salt Overly Sensitive)信號轉導途徑是目前研究最清楚的耐鹽途徑之一,SOS途徑的重要生理功能就是植物在鹽脅迫下進行離子穩(wěn)態(tài)調節(jié)和提高耐鈉性。SOS家族基因主要有SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、SOS5,其中SOS1、SOS2、SOS3三個基因參與介導了細胞內離子平衡的SOS信號轉導途徑。在高鹽信號刺激下使細胞內的Ca2+水平發(fā)生變化,Ca2+作為第二信使與SOS3結合啟動SOS信號途徑將鹽信號傳遞下去。本研究通過對剛毛檉柳轉錄組序列查找分析,篩選出4個SOS信號途徑全長基因(命名為ThSOS1、ThSOS2、ThSOS3-1、ThSOS3-2),對該信號基因進行了ExPASy-PROSITE分析、多序列比對和進化樹分析,利用實時熒光定量RT-PCR分析了不同脅迫處理下剛毛檉柳中4個ThSOS基因的表達,進一步通過穩(wěn)定轉化擬南芥和瞬時轉化檉柳分析了ThSOS3-1和ThSOS3-2基因的抗逆功能。具體研究結果如下:對4個ThSOS基因的生物信息學分析結果顯示ThSOS1為Na+/H+反轉運蛋白,編碼1165個氨基酸,分子量為128 KD,C端是一段位于細胞質內的具有親水性的尾巴,N端是由10-12個跨膜脂性區(qū)域組成的疏水區(qū);ThSOS2為一個Ser/Thr類蛋白激酶,編碼456個氨基酸,分子量為51.4KD,N端有一個長為26個氨基酸編碼的催化區(qū)域,C末端有一個長為21個氨基酸編碼的調節(jié)區(qū)域(FISL結構),這段序列同與其自身的N端催化區(qū)域結合引起SOS2激酶活性的自我抑制;ThSOS3蛋白編碼一個Ca2+結合蛋白,含有3個EF-臂的構型,和Ca2+具有較高的親和性,N-末端含有一個十四�；�(豆蔻�；�)的位點,其中ThSOS3-1基因具有一個典型FRQ1 Multi-domain結構域,ThSOS3-2基因具有Ca2+離子結合位點、EFh超級家族,FRQ1 Multi-domain結構域。多序列比對結果顯示4個ThSOSs基因之間序列一致性不高,但兩個ThSOS3基因(ThSOS3-1與ThSOS3-2)的氨基酸序列一致性為65%,與擬南芥AtSOS3基因歸為一組。為了分析4個ThSOSs基因是否參與檉柳逆境脅迫應答,利用實時定量RT-PCR分析了0.4MNaCl,20%(w/v)PEG6000和100μMABA脅迫處理后4個ThSOSs基因的表達情況,結果顯示,這4個基因都能對這些脅迫做出響應,但脅迫不同時間和檉柳的不同組織中的表達模式各不相同。這些基因在根中均上調表達,在葉中下調表達;NaCl和甘露醇脅迫處理后在根中的表達也較為相似,且發(fā)現4個ThSOSs基因對鹽信號及A]BA信號較為敏感。由于SOS3基因是SOS信號途徑的起始信號基因,而各基因在根中表達量的最大值相差不大,因此,進一步對兩個ThSOS3基因的抗逆功能進行了分析。構建了植物過表達載體pROKII-ThSOS3-1/hSOS3-2,將植物過表達載體pROKII-ThSOS3-1/ThSOS3-2穩(wěn)定轉化擬南芥,分析比較脅迫處理(NaCl、甘露醇)后轉ThSOS3-1/ThSOS3-2基因和野生型擬南芥形態(tài)和生理指標差異,以綜合評定ThSOS3-1和ThSOS3-2基因的抗逆功能。結果顯示,鹽和甘露醇脅迫后,轉ThSOS3-1和ThSOS3-2基因擬南芥的種子萌發(fā)率和鮮重都明顯高于對照。鹽和甘露醇脅迫后,過表達植株的長勢也強于野生型。進一步分析比較了轉基因植株與對照植株的生理染色和生理指標情況。NBT、DAB和伊文思藍化學染色分析結果表明,脅迫后轉基因pROKII-ThSOS3-1/ThSOS3-2植株的葉片著色比對照著色淺。轉pROKII-ThSOS3-1/ThSOS3-2基因植株中葉綠素含量和SOD、POD保護酶的活性明顯比野生型植株高,MDA含量和相對電導率值明顯比對照低。這些結果表明過表達ThSOS3-1/ThSOS3-2基因擬南芥在鹽和干旱脅迫后,能維持更高的保護酶活性,較低的細胞活性氧的含量,細胞損傷程度更輕。從而具有更高的抗旱耐鹽能力。為了驗證異源擬南芥表達的結果,進一步構建了抑制表達載體pFGC5941-Th7SOS3-1/ThSOS3-2,將過表達(pROKⅡ-ThSOS3-1/ThSOS3-2)、抑制表達(pFGC5941-ThSOS3-1/ThSOS3-2)及對照載體(pROKII)瞬時侵染檉柳,在檉柳中分析2個ThSOS3基因的耐鹽功能。NBT、DAB生理染色和SOD、POD生理指標測定的結果顯示,150mMNaCl脅迫處理后,過表達ThSOS3轉基因檉柳植株著色要比對照植株著色淺,抑制表達ThSOS3轉基因檉柳植株的葉片著色要比對照植株葉片著色深;過表達ThSOS3轉基因檉柳植株中SOD、POD保護酶的活性最強,而抑制表達ThSOS3轉基因檉柳植株中SOD、POD保護酶的活性最低,伊文思藍染色和MDA含量測定結果表明,鹽脅迫后,與對照相比,過表達ThSOS3轉基因檉柳植株著色淺且MDA含量低,抑制表達ThSOS3轉基因檉柳植株著色深且MDA含量高。表明SOS3基因可通過調節(jié)保護酶類的活性,增強細胞內清除活性氧能力,使細胞內的O2-·和H202這類活性氧物質的積累減少,增強植物的耐鹽性,是一個優(yōu)良的耐鹽基因。
【圖文】：

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【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S793.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳莎莎;蘭海燕;;植物對鹽脅迫響應的信號轉導途徑[J];植物生理學報;2011年02期

2 易善軍;孫振元;韓蕾;巨關升;錢永強;;植物耐堿機理及相關基因研究進展[J];世界林業(yè)研究;2011年01期

3 景欣;張e

本文編號：2631486