本文關鍵詞：二氧化硅包裹四氧化三鐵納米粒子標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外研究

  更多相關文章： 骨髓間充質(zhì)干細胞 四氧化三鐵納米粒子 二氧化硅 標記

【摘要】：研究背景:目前,由于再生醫(yī)學與組織工程學的發(fā)展與進步,干細胞技術(shù)也隨之逐步走向成熟,應用干細胞移植治療疾病已開始應用于臨床。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),因其具有易于分離培養(yǎng),免疫原性低,不涉及社會倫理問題,促進細胞植入和歸巢的特性等優(yōu)勢,已成為國內(nèi)外研究的熱點。大量研究證明,無論是自體還是異體來源的BMSCs移植,在動物實驗以及臨床試驗中均未見嚴重不良反應,無移植相關腫瘤形成,也未出現(xiàn)與移植相關的死亡案例,安全性較高。由于細胞在活體內(nèi)不能長期示蹤和動態(tài)監(jiān)測,無法及時準確地掌握細胞在體內(nèi)的分布、遷移、轉(zhuǎn)化和歸宿等信息,成為了阻礙BMSCs移植發(fā)展進步的一大難題。近年來,大量研究者使用超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)來標記BMSCs,并通過核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),根據(jù)靶組織器官的磁共振信號改變來反映移植細胞在體內(nèi)的情況,取得了良好的示蹤效果。二氧化硅(silicon dioxide,Si O2)包裹四氧化三鐵(ferroferric oxide,Fe3O4)納米粒子是以Fe3O4納米粒子為核心,具有超順磁性,可作為MRI的陰性對比劑使用。而且,包裹在納米粒子表面的二氧化硅層不但可以增加Fe3O4納米粒子的粒徑和分散性,提高組織兼容性,降低Fe3O4納米粒子的毒副作用,還可以防止Fe3O4納米粒子被分解為鐵離子而失去超順磁性,達到長期標記細胞的效果。此外,通過控制二氧化硅包裹納米粒子的合成條件,可以制備出能夠攜帶藥物或其他小分子物質(zhì)的磁性介孔二氧化硅納米粒子。因此,當使用攜帶有特定藥物的磁性介孔二氧化硅納米粒子標記BMSCs后,利用磁力靶向引導和BMSCs的歸巢特性,不僅可以動態(tài)監(jiān)測BMSCs在體內(nèi)的存活、分布、遷移、轉(zhuǎn)化和歸宿等生物學行為,還能起到靶向給藥的作用,達到干細胞移植與靶向藥物治療雙管齊下的目的。研究目的:本研究通過測量SiO_2@Fe_3O_4納米粒子對大鼠BMSCs的標記效率以及對大鼠bmscs細胞活力和細胞增殖的影響,探討SiO_2@Fe_3O_4納米粒子標記大鼠bmscs的最佳方案。利用mri體外成像研究SiO_2@Fe_3O_4納米粒子標記bmscs后示蹤的可行性,并初步確定體內(nèi)實驗的最佳細胞攝入量。為進一步探索bmscs移植后體內(nèi)示蹤,以及今后的臨床應用bmscs移植治療疾病提供可靠的實驗依據(jù)。研究方法:1.利用全骨髓貼壁法提取原代大鼠bmscs,經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)不斷純化,最終獲得足夠數(shù)量的細胞。2.通過觀察大鼠bmscs的細胞形態(tài)和生長特性,檢測細胞表面抗原的表達,以及體外多向誘導分化實驗,對獲得的細胞進行鑒定。3.化學共沉淀法合成Fe_3O_4納米粒子,采用stober法在Fe_3O_4納米粒子表面包裹SiO_2層,制備出SiO_2@Fe_3O_4納米粒子,并在透射電鏡下觀察其形態(tài)特征。4.配制不同鐵濃度(0、25、50、100、200μg/ml)的SiO_2@Fe_3O_4納米粒子標記培養(yǎng)液,與大鼠bmscs孵育24h后,普魯士藍染色觀察不同組SiO_2@Fe_3O_4納米粒子進入細胞的情況,并測定不同標記濃度下的陽性細胞標記率。5.各組SiO_2@Fe_3O_4納米粒子標記培養(yǎng)液與大鼠bmscs孵育后,在不同時間點對標記細胞進行臺盼藍拒染實驗檢測細胞活性。6.利用cck-8試劑盒檢測不同濃度SiO_2@Fe_3O_4納米粒子對大鼠bmscs的細胞毒性以及對細胞增殖活性的影響。7.根據(jù)以上結(jié)果總結(jié)出SiO_2@Fe_3O_4納米粒子標記大鼠bmscs的最佳方案。選取最佳濃度和時間體外標記大鼠bmscs后,觀察mri成像效果。研究結(jié)果:1.利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離提取的大鼠bmscs,經(jīng)過多次換液和傳代,可以對其純化,并在第3代時,獲得了形態(tài)一致的大鼠bmscs。2.經(jīng)傳代培養(yǎng)后,細胞在形態(tài)和生長特性方面符合大鼠bmscs特征;流式細胞儀檢測結(jié)果顯示高表達mscs表面標志物cd44、cd90,而低表達cd34、cd45;成脂及成骨誘導分化實驗表明該細胞可以向脂肪細胞和骨細胞分化。證明提取和傳代培養(yǎng)的細胞為大鼠bmscs。3.制備出的SiO_2@Fe_3O_4納米粒子以球形為主,核心為單個或多個Fe_3O_4納米粒子,外部為Si O2層,粒徑大小為50~100 nm,具有超順磁性和良好的分散性。4.普魯士藍染色顯示SiO2@Fe3O4納米粒子可被細胞攝取,集中在核周和細胞膜邊緣,隨著標記液鐵濃度的增高,胞質(zhì)內(nèi)藍染顆粒顏色加深;標記率與標記濃度正相關,各組標記率均達到95%以上,并且與25μg/ml組相比,50、100和200μg/ml組的標記率差異均具有統(tǒng)計學意義。5.臺盼藍拒染實驗結(jié)果顯示SiO2@Fe3O4納米粒子與大鼠BMSCs孵育24 h后,200μg/ml組細胞出現(xiàn)了活性降低,具有統(tǒng)計學差異,而其他各組細胞活性均無明顯影響;CCK-8毒性實驗結(jié)果表明孵育24 h后,高濃度組(100、200μg/ml)SiO_2@Fe_3O_4納米粒子對大鼠BMSCs具有毒性。6.用50μg/ml鐵濃度的SiO2@Fe3O4納米粒子標記大鼠BMSCs 24 h后,1.5T MRI掃描成像結(jié)果顯示,當標記細胞濃度為2.5×105個/ml時,在T2序列出現(xiàn)明顯的信號降低,并且細胞濃度越高,信號降低越明顯。結(jié)論:1.通過化學共沉淀法和Stober法可以制備出大小均一,粒徑適中,具有超順磁性和良好分散性的SiO2@Fe3O4納米粒子。2.SiO_2@Fe_3O_4納米粒子可以成功標記大鼠BMSCs,并且在一定的安全濃度(25~50 ug/ml)下對大鼠BMSCs無毒副作用。3.大鼠BMSCs經(jīng)SiO2@Fe3O4納米粒子標記后,可在MRI中T2序列清晰地觀察到低信號顯像,為下一步大鼠BMSCs移植體內(nèi)示蹤奠定實驗基礎。
【關鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞 四氧化三鐵納米粒子 二氧化硅 標記
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 緒論16-18
• 第1章 文獻綜述18-25
• 1.1 干細胞移植18-19
• 1.1.1 干細胞分類18
• 1.1.2 干細胞臨床應用18
• 1.1.3 骨髓間充質(zhì)干細胞移植18-19
• 1.2 干細胞體內(nèi)示蹤19-21
• 1.2.1 外源性標記基因轉(zhuǎn)染19
• 1.2.2 熒光染料標記19-20
• 1.2.3 同位素標記20
• 1.2.4 超順磁性氧化鐵標記20-21
• 1.3 四氧化三鐵納米粒子21-22
• 1.3.1 Fe_3O_4粒子的性質(zhì)21
• 1.3.2 Fe_3O_4納米粒子的制備21
• 1.3.3 Fe_3O_4納米粒子的表面修飾21-22
• 1.4 磁性介孔二氧化硅納米粒子22-23
• 1.4.1 介孔氧化硅納米粒子簡介22
• 1.4.2 磁性介孔二氧化硅納米粒子的合成22-23
• 1.4.3 磁性介孔二氧化硅納米粒子應用于干細胞移植的優(yōu)勢23
• 1.5 小結(jié)23-25
• 第2章 大鼠BMSCS的分離培養(yǎng)和鑒定25-34
• 前言25
• 2.1 實驗材料25-28
• 2.1.1 實驗動物25
• 2.1.2 主要實驗儀器25-26
• 2.1.3 主要實驗試劑26-27
• 2.1.4 試劑配制27-28
• 2.2 實驗方法28-30
• 2.2.1 原代BMSCs的分離和培養(yǎng)28
• 2.2.2 BMSCs的擴增和凍存28-29
• 2.2.3 BMSCs表面標志鑒定29
• 2.2.4 BMSCs的成脂誘導分化29
• 2.2.5 BMSCs的成骨誘導分化29-30
• 2.3 實驗結(jié)果30-32
• 2.3.1 BMSCs形態(tài)學特征30-31
• 2.3.2 BMSCs表面標志物的表達31-32
• 2.3.3 BMSCs 成脂及成骨誘導分化潛能32
• 2.4 討論32-33
• 2.5 小結(jié)33-34
• 第3章 二氧化硅包裹四氧化三鐵納米粒子的制備及其標記大鼠BMSCS的體外研究34-45
• 前言34
• 3.1 實驗材料34-37
• 3.1.1 主要實驗儀器34-35
• 3.1.2 主要實驗試劑35-36
• 3.1.3 試劑配制36-37
• 3.2 實驗方法37-39
• 3.2.1 SiO_2@Fe_3O_4納米粒子的制備37
• 3.2.2 普魯士藍染色檢測細胞標記率37-38
• 3.2.3 臺盼藍拒染實驗檢測標記細胞活性38
• 3.2.4 CCK-8 檢測細胞增殖活性38
• 3.2.5 標記細胞 1.5T MRI掃描成像38
• 3.2.6 統(tǒng)計學分析38-39
• 3.3 實驗結(jié)果39-43
• 3.3.1 SiO_2@Fe_3O_4納米粒子的性狀39-40
• 3.3.2 SiO_2@Fe_3O_4納米粒子標記細胞的陽性率40-41
• 3.3.3 SiO_2@Fe_3O_4納米粒子孵育時間和標記濃度對細胞活力的影響41-42
• 3.3.4 SiO_2@Fe_3O_4納米粒子的細胞毒性42-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 第4章 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-53
• 作者簡介及在學期間取得科研成果53-54
• 致謝54

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本文編號：942830