本文關(guān)鍵詞：APE1乙�；{(diào)節(jié)Beclin1依賴的細(xì)胞自噬提高放療敏感性

  更多相關(guān)文章： 電離輻射 APE1乙�；� 自噬 Hela細(xì)胞 Genistein Beclin1 Bcl-xl 自噬 NSCLC

【摘要】：第一部分:APE1乙酰化調(diào)節(jié)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬研究背景:放射治療是晚期腫瘤主要的治療手段,但放療抵抗的現(xiàn)象普遍存在。APE1/Ref-1,DNA損傷修復(fù)和氧化還原(redox)雙功能基因,作為提高放射治療敏感性的靶點(diǎn)已經(jīng)被廣泛證實(shí),但具體機(jī)制還在探索中。APE1是一個(gè)多功能蛋白,具有氧化還原一些轉(zhuǎn)錄因子(如P53、AP-1、PTEN、NF-kb等)和DNA堿基損傷修復(fù)的功能。乙酰化、磷酸化、泛素化都是APE1翻譯后修飾的方式,但APE1乙�；揎椨葹橹匾�。APE1的N末端有多個(gè)位點(diǎn)能被乙�；D(zhuǎn)移酶修飾,尤其K6/K7位點(diǎn)的乙酰化修飾與APE1多種活性密切相關(guān),如與n Ca RE序列、YB-1介導(dǎo)的MDR1基因激活和BER功能密切相關(guān)。自噬是細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng),應(yīng)激刺激時(shí)細(xì)胞自我吞噬和降解細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)壽蛋白和細(xì)胞器,從而維持細(xì)胞存活。細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療存在密切的關(guān)系。為了探索APE1乙�；c電離輻射(Ionizing Radiation IR)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬之間的關(guān)系,我們利用IR處理,觀察Hela細(xì)胞APE1乙酰化水平、細(xì)胞自噬水平的變化及可能的機(jī)制,為APE1作為放射治療的的靶點(diǎn)提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。研究目的:探討脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶?氧化還原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)乙�；瘜�(duì)電離輻射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。研究方法:給予Elekta precise直線加速器處理Hela細(xì)胞0、2、4Gy照射24小時(shí),或2Gy照射0、6、24、48小時(shí)后,應(yīng)用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的方法檢測(cè)APE1乙�；揎椉癇eclin1/Bcl2的結(jié)合,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬的水平,免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)LC3的聚集,Western blot檢測(cè)APE1、LC3和p62的表達(dá)。研究結(jié)果:Hela細(xì)胞APE1乙酰化水平隨著照射劑量的增加和照射后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高(P0.05)。Hela細(xì)胞LC3Ⅱ的表達(dá)與照射劑量正相關(guān),而與P62呈負(fù)相關(guān)(P0.05);電離輻射促進(jìn)細(xì)胞的自噬水平和LC3的聚集。電離輻射后,LC3Ⅱ上調(diào);與對(duì)照組APE1WT相比,APE1K6R/K7R細(xì)胞Beclin1/Bcl2結(jié)合增強(qiáng),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,P62表達(dá)上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:APE1乙酰化通過Beclin1/Bcl2途徑調(diào)節(jié)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬。第二部分:genistein調(diào)節(jié)Beclin1依賴的細(xì)胞自噬促進(jìn)放療敏感性研究背景:放射治療最近把提高輻射精度,降低腫瘤發(fā)病率,減少對(duì)腫瘤組織劑量不足和對(duì)正常組織劑量過大機(jī)率考慮在內(nèi)。為了更好達(dá)到腫瘤治療的目的,放射治療的輔助用藥應(yīng)運(yùn)而生。Genistein是黃豆天然產(chǎn)物大豆異黃酮的主要成分,一些體內(nèi)體外研究證實(shí),在前列腺癌,乳腺癌,結(jié)腸癌,胃癌,肺癌,胰腺癌,淋巴瘤中具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。Genistein明顯的提高腫瘤放射治療的療效,也能減輕放射治療對(duì)正常組織引起的炎性損傷。Genistein能夠提高化學(xué)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬水平,其具體機(jī)制還不清楚。Bcl-xl是bcl2家族的成員,與bcl-2蛋白均是抗凋亡蛋白的成員之一,bcl-xl在肺癌細(xì)胞中表達(dá)高于bcl-2。Bcl-xl的在前列腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)和下調(diào)直接影響pc-3細(xì)胞對(duì)治療的敏感性。Bcl-xl與線粒體穩(wěn)定的結(jié)合,抑制凋亡蛋白與線粒體的結(jié)合而抑制凋亡的發(fā)生;bcl-2家族抗凋亡蛋白定位于細(xì)胞核,主要是通過下調(diào)堿基切除修復(fù)酶APE1并與DNA修復(fù)酶APE1、XRCC1、c-Myc等相互結(jié)合抑制酶的活性抑制堿基切除修復(fù)。大量研究證實(shí),Genistein抑制腫瘤細(xì)胞G2/M期促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[1,2],也促進(jìn)肺部腫瘤放射治療和化學(xué)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平。Bcl-xl蛋白主要定位在線粒體膜,維持線粒體的穩(wěn)定、阻止細(xì)胞色素C的釋放和caspase蛋白的激活,發(fā)揮抗凋亡的功能�，F(xiàn)在證據(jù)表明bcl-xl蛋白也定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細(xì)胞核,并發(fā)揮一定的功能。Bcl-xl和Beclin1之間通過BH3區(qū)域相互結(jié)合組成的復(fù)合物是自噬調(diào)控的一個(gè)開關(guān)。自噬是一個(gè)細(xì)胞自我分解的過程,細(xì)胞把要降解和循環(huán)利用長(zhǎng)壽蛋白和細(xì)胞器吞入溶酶體進(jìn)行降解,降解的細(xì)胞器有線粒體,過氧化物酶體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在機(jī)體處于饑餓和應(yīng)激的正常情況下,自噬是有利于細(xì)胞存活的;但是越來越多的證據(jù)表明自噬過度刺激或始終激活,自噬也是促進(jìn)細(xì)胞死亡的程序。細(xì)胞自噬水平的過高或過低都不利細(xì)胞存活,許多抗腫瘤治療大多是誘導(dǎo)自噬發(fā)生。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的紊亂可在治療抵抗的腫瘤中普遍存在,幾乎所有的腫瘤都能維持凋亡的核心調(diào)控機(jī)制。Genistein促進(jìn)腫瘤治療誘導(dǎo)的凋亡水平,單用和聯(lián)用genistein明顯的抑制細(xì)胞漿內(nèi)的bcl-xl的蛋白量。對(duì)于bcl2抗凋亡家族蛋白高表達(dá)的肺部腫瘤,genistein通過多種機(jī)制促進(jìn)凋亡的發(fā)生�？沟蛲龅鞍譩cl-2家族與Beclin1結(jié)合發(fā)揮抗自噬活性,也是維持細(xì)胞存活的途徑。改變抗細(xì)胞調(diào)往的bcl-2家族蛋白的入核情況和與Beclin1之間結(jié)合是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性凋亡的機(jī)制之一。研究目的:探索Genistein引起NSCLC細(xì)胞中Bcl-xl亞細(xì)胞定位的改變與IR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、自噬之間的關(guān)系,為提高放射治療敏感性、減輕放射治療損傷反應(yīng)提供可靠的輔助手段。研究方法:利用細(xì)胞漿細(xì)胞核蛋白提取試劑盒分別提取核漿蛋白;通過western Blot的方法檢測(cè)各種凋亡自噬標(biāo)志蛋白表達(dá);用免疫熒光的方法檢測(cè)A549細(xì)胞Bcl-xl亞細(xì)胞定位的改變;流式細(xì)胞儀是在細(xì)胞水平檢測(cè)凋亡和自噬水平。研究結(jié)果:肺癌細(xì)胞系胞漿Bcl-xl蛋白含量的差異影響IR誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞抗凋亡能力;Genistein改變A549細(xì)胞Bcl-xl蛋白的亞細(xì)胞定位,抑制IR誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù),促進(jìn)Bcl-xl/Beclin1復(fù)合物的解離提高細(xì)胞的自噬水平,促進(jìn)Bcl-2家族相關(guān)的多重凋亡途徑,而且NSCLC胞漿Bcl-xl表達(dá)水平與放射治療后ORR(Objective response rate)明顯相關(guān)。結(jié)論:總之,我發(fā)現(xiàn),genistein改變bcl-xl核漿亞細(xì)胞定位,抑制放射治療誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù),啟動(dòng)bcl-2家族相關(guān)的線粒體凋亡途徑,促進(jìn)bcl-xl/Beclin1復(fù)合物的解離提高細(xì)胞自噬水平,從而激活放射治療誘導(dǎo)的多重凋亡機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：電離輻射 APE1乙�；� 自噬 Hela細(xì)胞 Genistein Beclin1 Bcl-xl 自噬 NSCLC
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.55
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 APE1乙�；{(diào)節(jié)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬16-22
• 2.1 材料與方法16-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-20
• 2.3 討論20-22
• 第三章 genistein調(diào)節(jié)Beclin1依賴的細(xì)胞自噬促進(jìn)放療敏感性22-34
• 3.1 材料與方法22-24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-32
• 3.3 討論32-34
• 全文總結(jié)34-35
• 參考文獻(xiàn)35-39
• 文獻(xiàn)綜述 APE1及APE1乙�；{(diào)節(jié)自噬的活性提高放射治療敏感性39-51
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文51-52
• 致謝52

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