發(fā)布時(shí)間：2017-09-21 13:51

  本文關(guān)鍵詞：新型聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹磷酸鈣納米粒復(fù)合載體用于基因傳遞的研究

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【摘要】：基因治療為遺傳性疾病、傳染病和癌癥等的治療提供了良好的前景,而研制安全有效的基因傳遞系統(tǒng)將成為基因治療研究的最重要方向之一。本文針對(duì)目前siRNA轉(zhuǎn)染效率低,體內(nèi)穩(wěn)定性差等問(wèn)題,結(jié)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體和磷酸鈣納米粒的特點(diǎn),構(gòu)建內(nèi)水相為磷酸鈣-siRNA納米粒,外層包裹聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的新型核-膜型復(fù)合載體,對(duì)其制備工藝進(jìn)行了探討,并研究了該載體的性質(zhì)、細(xì)胞毒性、攝取、體外轉(zhuǎn)染效率和體外基因沉默效率,最后考察該載體攜載VEGF-siRNA在體內(nèi)針對(duì)腫瘤微血管生成的抑制作用,以期為非病毒siRNA載體的設(shè)計(jì)提供新的思路和方法學(xué)基礎(chǔ)。目的：通過(guò)分析siRNA傳遞過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外的主要屏障并根據(jù)siRNA細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制和靶點(diǎn),在傳統(tǒng)磷酸鈣載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建具有陽(yáng)離子聚合物和陽(yáng)離子脂質(zhì)特點(diǎn)、雙重內(nèi)體逃逸能力和腫瘤靶向的新型核-膜型siRNA復(fù)合載體,為非病毒siRNA載體的設(shè)計(jì)提供參考。方法：①聚乙烯亞胺-膽固醇的合成及表征。選用低分子量的聚乙烯亞胺(PEI),通過(guò)化學(xué)方式在其骨架上共價(jià)結(jié)合膽固醇,合成聚乙烯亞胺-膽固醇(PEI 800-Chol),并考察了化合物的基本性質(zhì)。②磷酸鈣納米粒的制備及表征。通過(guò)微乳法和共沉淀法制備磷酸鈣納米粒,考察納米粒制備中的影響因素、納米粒的基本性質(zhì),選擇適合的制備途徑,并利用瓊脂糖凝膠電泳考察磷酸鈣納米粒攜載siRNA能力,確定載體與siRNA的孵育比例。③聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體／磷酸鈣納米粒復(fù)合載體(PLCP)的制備。通過(guò)脂質(zhì)體包裹技術(shù)控制磷酸鈣納米粒的粒徑,并對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行陽(yáng)離子聚合物修飾,考察聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體PCL和復(fù)合載體PLCP的形狀、粒徑及表面電位,測(cè)定復(fù)合載體PLCP的緩沖能力、細(xì)胞毒性,對(duì)PLCP的凍干保護(hù)劑進(jìn)行了篩選,并對(duì)其體外轉(zhuǎn)染能力做了初步評(píng)價(jià)。④復(fù)合載體細(xì)胞攝取評(píng)價(jià)�？疾鞆�(fù)合載體PLCP的細(xì)胞攝取能力,比較CaPNP、PCL、LipofectamineTM2000和PLCP四種不同載體在MCF-7細(xì)胞中的攝取能力,考察不同N/P對(duì)PLCP細(xì)胞攝取的影響,通過(guò)不同脂質(zhì)構(gòu)建復(fù)合載體,考察DOPE對(duì)復(fù)合載體細(xì)胞攝取的影響。⑤復(fù)合載體PLCP介導(dǎo)的siRNA體外基因沉默研究。一方面,通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)GFP的siRNA干擾片段,以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為細(xì)胞模型,選擇PLCP進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證,并檢測(cè)經(jīng)PLCP介導(dǎo)后anti-GFP siRNA對(duì)細(xì)胞模型內(nèi)GFP mRNA表達(dá)的影響。另一方面,通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF的siRNA干擾片段,以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為細(xì)胞模型,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blot測(cè)定經(jīng)PLCP介導(dǎo)后anti-VEGF siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF-mRNA和VEGF蛋白表達(dá)的抑制作用。⑥復(fù)合載體PLCP介導(dǎo)的siRNA抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究。建立MCF-7細(xì)胞裸鼠成瘤模型,研究復(fù)合載體PLCP介導(dǎo)的anti-VEGF siRNA在抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤血管形成方面的作用。結(jié)果：①通過(guò)低分子量PEI(800Da)和膽固醇甲酰氯經(jīng)反應(yīng)合成PEI 800-Chol。經(jīng)1H-NMR和紅外光譜檢測(cè),膽固醇甲酰氯的酰氯基與PEI分子的胺基反應(yīng)生成酰胺基,膽固醇共價(jià)結(jié)合到PEI分子骨架上,產(chǎn)物中沒(méi)有包裹單體的膽固醇甲酰氯或其水解后的產(chǎn)物及羧基產(chǎn)物。②通過(guò)微乳法和共沉淀法制備磷酸鈣納米粒。微乳法制備中,選定Triton X-100/正已醇=3:2(w/w)、(Triton X-100+正已醇)/環(huán)已烷=6：4(w/w)為微乳液各組分之間的最佳比例,制得的CaP NP粒徑為15.2±1.7nm,PDI為0.206±0.029,表面電位為-5.4±1.6mV。共沉淀法制備中,溶液的pH維持在6.95±0.65之間時(shí),體系較為平穩(wěn),A、B兩種溶液不同配比對(duì)納米粒的粒徑有明顯影響,當(dāng)B液：A液=1時(shí),可以得到最佳粒徑。制得的CaP NP粒徑為148.9±21.8nm, PDI為0.248±0.017,表面電位為-13.6±1.0mV。通過(guò)比較兩種制備方法,最終選定共沉淀法作為磷酸鈣納米粒的制備方法。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)CaP NP與siRNA質(zhì)量比為15：1時(shí),可以完全阻滯siRNA泳動(dòng)。③在傳統(tǒng)磷酸鈣載體和脂質(zhì)載體基礎(chǔ)上,構(gòu)建了內(nèi)水相為磷酸鈣/siRNA納米粒,外層包裹聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的新型核-膜型復(fù)合載體PLCP。通過(guò)薄膜分散法制備聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體PCL,制得的PCL/siRNA粒徑為129.6±14.0nm, PDI為0.200±0.023,表面電位為39.3±6.2mV。復(fù)合載體PLCP的平均粒徑為260.4±23.4 nm, PDI為0.188±0.038,表面電位為0.3±0.2mV,緩沖能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明PLCP的緩沖能力介于PCL和PEI800之間,具有較強(qiáng)的緩沖能力。凍干保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)表明5%體系質(zhì)量的甘露醇為最佳凍干保護(hù)劑。PLCP的細(xì)胞毒性明顯小于PEI(分子量25kDa)/siRNA混合物,表現(xiàn)出較高的安全性,而其轉(zhuǎn)染效率與PEI(分子量25kDa)/siRNA混合物相當(dāng)。④通過(guò)比較CaP NP、PCL、LipofectamineTM 2000和PLCP四種不同載體在MCF-7細(xì)胞中的攝取能力,結(jié)果顯示,PLCP介導(dǎo)的siRNA表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。不同N/P對(duì)PLCP細(xì)胞攝取有顯著影響,隨著N/P的增加,熒光強(qiáng)度也增強(qiáng),當(dāng)N/P為20,熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值,然后緩慢下降。通過(guò)構(gòu)建PLCPs和PLCP兩種復(fù)合載體,考察DOPE對(duì)復(fù)合載體細(xì)胞攝取的影響,結(jié)果表明PLCP介導(dǎo)的siRNA表達(dá)要明顯優(yōu)于PLCPs.⑤通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)GFP的siRNA干擾片段,以穩(wěn)篩GFP熒光蛋白的MCF-7為細(xì)胞模型,選擇PLCP進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證,結(jié)果顯示GFP-443為最佳序列。體外基因沉默實(shí)驗(yàn)檢測(cè)載體介導(dǎo)anti-GFP siRNA對(duì)細(xì)胞模型內(nèi)GFPmRNA表達(dá)的影響,通過(guò)熒光圖像和RT-qPCR法檢測(cè),結(jié)果顯示CaP NP組未表現(xiàn)出明顯基因沉默效應(yīng),PCL組可以有效地抑制GFP表達(dá),但是,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加,抑制效率反而下降,PLCP和LipofectamineTM 2000在整個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)間(0-72h)可顯著抑制GFP表達(dá),在48h-72h,PLCP的沉默效率達(dá)到80%,明顯高于LipofectamineTM 2000 (-60%)。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF的siRNA干擾片段,以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為細(xì)胞模型,通過(guò)RT-qPCR法和Western blot測(cè)定經(jīng)PLCP介導(dǎo)后anti-VEGF siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA和VEGF蛋白表達(dá)的抑制作用。RT-qPCR結(jié)果表明,PLCP/VEGF siRNA2組表現(xiàn)出最優(yōu)的沉默效率,VEGF siRNA則比隨機(jī)序列的siRNA基因沉默效率更為顯著。通過(guò)比較3個(gè)序列的VEGF siRNA以及與LipofectamineTM 2000組間的對(duì)比,VEGF-1137序列的siRNA可以獲得非常低的VEGF表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)設(shè)計(jì)篩選的VEGF siRNA比隨機(jī)序列的siRNA抑制蛋白表達(dá)作用更強(qiáng)。72h總體分析可見(jiàn),PLCP/VEGF siRNA組抑制VEGF-A表達(dá)作用持續(xù)而穩(wěn)定,與LipofectamineTM 2000/VEGF siRNA組對(duì)比,具有一定優(yōu)勢(shì)。⑥通過(guò)建立MCF-7細(xì)胞裸鼠成瘤模型,研究了復(fù)合載體PLCP介導(dǎo)的siRNA-VEGF在抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤血管形成方面的作用。裸鼠皮下注射MCF-7細(xì)胞懸液,在第10天順利成瘤,待腫瘤長(zhǎng)至50-100mm3,隨機(jī)分七組可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制腫瘤生長(zhǎng)及抗腫瘤血管形成的效果判斷：腫瘤生長(zhǎng)體積方面,注射PLCP/siRNA-VEGF聯(lián)合阿霉素組腫瘤體積明顯減少；腫瘤微血管密度方面,注射PLCP/siRNA-VEGF聯(lián)合阿霉素組和單純注射PLCP/siRNA-VEGF組與各對(duì)照組相比的微血管密度明顯降低；相關(guān)蛋白免疫組化測(cè)定方面,注射PLCP/siRNA-VEGF聯(lián)合阿霉素組和單純注射PLCP/siRNA-VEGF組的VEGF、 AKT2和HIF-1α的蛋白表達(dá)量與各對(duì)照組相比明顯減少。結(jié)論：本研究構(gòu)建了一種新型的用于RNAi基因沉默的PLCP傳遞系統(tǒng)。通過(guò)共沉淀法制備磷酸鈣納米粒,外層包裹聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體PCL形成PLCP復(fù)合載體。載基因PLCP具有內(nèi)體逃逸能力、低細(xì)胞毒性、高效的基因沉默效率和體內(nèi)抑瘤能力,為有效傳遞治療用siRNA提供了潛在的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：磷酸鈣納米粒 聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體 siRNA 轉(zhuǎn)染效率 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 基因沉默 抑瘤作用
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R450
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-9
• ABSTRACT9-17
• 縮寫(xiě)、符號(hào)、術(shù)語(yǔ)表17-24
• 引言24-27
• 第一章 聚乙烯亞胺-膽固醇的合成及表征27-31
• 1 材料與儀器27
• 1.1 材料和試劑27
• 1.2 儀器27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-28
• 2.1 聚乙烯亞胺—膽固醇的合成27-28
• 2.2 核磁共振波譜(~1H-NMR)檢測(cè)28
• 2.3 紅外光譜檢測(cè)28
• 3 結(jié)果與討論28-30
• 3.1 ~1H-NMR檢測(cè)結(jié)果28-29
• 3.2 紅外光譜檢測(cè)結(jié)果29-30
• 4 小結(jié)30-31
• 第二章 磷酸鈣納米粒的制備及表征31-41
• 1 材料與儀器31
• 1.1 材料和試劑31
• 1.2 儀器31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 2.1 微乳法制備磷酸鈣納米粒31-32
• 2.1.1 微乳液的制備及三元體系擬相圖繪制31
• 2.1.2 微乳法制備磷酸鈣納米粒31-32
• 2.1.3 微乳法中去除有機(jī)相的后處理方法比較32
• 2.2 共沉淀法制備磷酸鈣納米粒32
• 2.2.1 共沉淀法制備磷酸鈣納米粒32
• 2.2.2 共沉淀法制備磷酸鈣納米粒的影響因素考察32
• 2.3 CaP NP的形態(tài)觀察32-33
• 2.4 CaP NP的粒徑及電位測(cè)定33
• 2.5 瓊脂糖凝膠電泳33
• 3 結(jié)果與討論33-39
• 3.1 三元體系擬相圖33-34
• 3.2 共沉淀法制備磷酸鈣納米粒的影響因素考察34
• 3.3 CaP NP的形態(tài)觀察34-35
• 3.4 CaP NP粒徑及電位測(cè)定35-38
• 3.5 兩種制備方法的比較38
• 3.6 瓊脂糖凝膠電泳38-39
• 4 小結(jié)39-41
• 第三章 聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體/磷酸鈣納米粒復(fù)合載體的制備41-52
• 1 材料與儀器41-42
• 1.1 材料和試劑41
• 1.2 胞41
• 1.3 儀器41-42
• 2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 2.1 聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體(PCL)的制備42
• 2.2 聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體/磷酸鈣納米粒復(fù)合載體(PLCP)的制備42
• 2.3 PCL和PLCP的形態(tài)觀察42
• 2.4 PCL/siRNA和PLCP的表征42
• 2.5 PLCP緩沖能力的測(cè)定42
• 2.6 PLCP的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)42-43
• 2.7 PLCP凍干保護(hù)劑的篩選43
• 2.8 PLCP的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)43
• 3 結(jié)果與討論43-51
• 3.1 PCL和PLCP的形態(tài)觀察43-45
• 3.2 PCL/siRNA和PLCP的表征45-46
• 3.3 PLCP緩沖能力的測(cè)定46-47
• 3.4 PLCP細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)47-49
• 3.5 PLCP凍干保護(hù)劑篩選49-50
• 3.6 PLCP體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)50-51
• 4 小結(jié)51-52
• 第四章 復(fù)合載體細(xì)胞攝取評(píng)價(jià)52-58
• 1 材料與儀器52
• 1.1 材料和試劑52
• 1.2 細(xì)胞52
• 1.3 儀器52
• 2 實(shí)驗(yàn)方法52-53
• 2.1 不同載體的細(xì)胞攝取研究52-53
• 2.2 不同N/P對(duì)PLCP細(xì)胞攝取的影響53
• 2.3 DOPE對(duì)PLCP細(xì)胞攝取的影響53
• 3 結(jié)果與討論53-57
• 3.1 不同載體的細(xì)胞攝取研究53-54
• 3.2 不同N/P對(duì)PLCP細(xì)胞攝取的影響54-56
• 3.3 DOPE對(duì)PLCP細(xì)胞攝取的影響56-57
• 4 小結(jié)57-58
• 第五章 復(fù)合載體介導(dǎo)的siRNA體外基因沉默研究58-78
• 1 復(fù)合載體介導(dǎo)的anti-GFP siRNA體外基因沉默研究58-69
• 1.1 材料與儀器58-59
• 1.1.1 材料和試劑58
• 1.1.2 細(xì)胞58
• 1.1.3 儀器58-59
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法59-60
• 1.2.1 anti-GFP siRNA序列篩選59
• 1.2.2 復(fù)合載體介導(dǎo)的anti-GFP siRNA體外基因沉默實(shí)驗(yàn)59-60
• 1.2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染59-60
• 1.2.2.2 總RNA的提取60
• 1.2.2.3 RT-qPCR分析60
• 1.3 結(jié)果與討論60-68
• 1.3.1 anti-GFP siRNA序列篩選60-66
• 1.3.2 復(fù)合載體介導(dǎo)的anti-GFP siRNA體外基因沉默實(shí)驗(yàn)66-68
• 1.4 小結(jié)68-69
• 2 復(fù)合載體介導(dǎo)的VEGF siRNA體外基因沉默研究69-78
• 2.1 材料與儀器69-70
• 2.1.1 材料和試劑69
• 2.1.2 細(xì)胞69
• 2.1.3 儀器69-70
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法70-71
• 2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染70
• 2.2.2 總RNA的提取70
• 2.2.3 RT-qPCR分析70-71
• 2.2.4 WB測(cè)定VEGF蛋白表達(dá)71
• 2.3 結(jié)果與討論71-76
• 2.3.1 RT-qPCR法測(cè)定VEGF mRNA表達(dá)71-73
• 2.3.2 Western blot測(cè)定VEGF蛋白表達(dá)73-76
• 2.4 小結(jié)76-78
• 第六章 復(fù)合載體介導(dǎo)的siRNA抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究78-91
• 1 材料與儀器78-79
• 1.1 材料與試劑78
• 1.2 細(xì)胞78
• 1.3 動(dòng)物78
• 1.4 儀器78-79
• 2 實(shí)驗(yàn)方法79-81
• 2.1 主要試劑配制79
• 2.2 裸鼠成瘤79
• 2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥79-80
• 2.4 皮下腫瘤體積及生長(zhǎng)抑制率觀察80
• 2.5 免疫組織化學(xué)80-81
• 2.6 微血管密度(MVD)測(cè)定81
• 3 結(jié)果與討論81-89
• 3.1 PLCP介導(dǎo)的siRNA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用81-84
• 3.2 PLCP介導(dǎo)的siRNA對(duì)腫瘤血管形成的作用84-89
• 4 小結(jié)89-91
• 全文總結(jié)91-93
• 參考文獻(xiàn)93-98
• 綜述98-112
• 參考文獻(xiàn)106-112
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果112

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4 魏s，

本文編號(hào)：894904