本文關鍵詞：河南地區(qū)耐碳青霉烯類藥物銅綠假單胞菌耐藥機制研究

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【摘要】：背景與目的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是醫(yī)院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一,特別是在重癥監(jiān)護病房、呼吸科以及燒傷科。該菌正常情況下不會引起人類疾病,當人體免疫力低下、定植部位改變以及菌群失調(diào)時,導致人類感染。近些年來,由于抗生素的濫用情況日益嚴重,又因其固有的和獲得性的耐藥機制而使其對多種藥物都能產(chǎn)生嚴重耐藥,從而出現(xiàn)了多重耐藥(multi-drug resistant,MDR)甚至泛耐藥(pan-drug resistant,PDR)銅綠假單胞菌。碳青霉烯類抗生素是臨床治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染的重要手段之一。但是,隨著抗生素的濫用越來越嚴重,菌株對碳青霉烯類藥物耐藥現(xiàn)象越來越嚴重,耐藥率呈逐年增高趨勢,臨床對于此類細菌所致感染幾乎陷于束手無策、無藥可用的困境。銅綠假單胞菌針對碳青霉烯類藥物耐藥主要有幾個方面的原因,具體包括碳青霉烯酶的產(chǎn)生、主動外排泵過度表達、外膜通透性的改變、整合子介導耐藥性改變等,其中,最為主要的是碳青霉烯酶的產(chǎn)生和外膜通透性的改變。碳青霉烯酶按Ambler分類分為三類,銅綠假單胞菌攜帶的主要是Ambler B類金屬酶。而產(chǎn)生Ambler B類金屬酶是目前該菌株對碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因。資料顯示,國內(nèi)外主要檢測到六種Ambler B類金屬酶,分別為IMP、VIM、SPM、SIM、GIM和NDM。銅綠假單胞菌攜帶的主要是IMP和VIM。早期發(fā)現(xiàn)的OXA酶屬于窄譜性水解酶類,如0XA-1、0XA-2、OXA-10等。近年來,超廣譜性OXA酶,甚至水解碳青霉稀類的OXA酶報道不斷增多,但這些酶類除OXA-15和OXA-32超廣譜酶外,其它的廣譜OXA酶大多來自OXA-10的突變。外膜孔蛋白Opr D2(outer-membrane protein D2,Opr D2)的缺失也可導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥,并且通道蛋白的缺失往往伴隨有外排泵系統(tǒng)系統(tǒng)的過度表達,這兩者都在碳青霉烯類藥物耐藥產(chǎn)生過程中起著重要作用。整合子是細菌間的可移動遺傳元件,其上多定位有多種耐藥基因,且可在同種或異種細菌間傳遞,從而導致耐藥性廣泛傳播。目前國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的整合子主要有三類,分別為intⅠ、intⅡ、intⅢ,銅綠假單胞菌主要攜帶的為Ⅰ類整合子。依據(jù)國內(nèi)外針對銅綠假單胞菌耐藥性的研究現(xiàn)狀,我們設計了本課題,旨在通過分析本地區(qū)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥性表型,探究菌株所攜帶的碳青霉烯酶基因型種類、菌株通道蛋白表達狀況以及菌株所攜帶整合子及其耐藥基因盒種類,從而揭示本地區(qū)的銅綠假單胞菌耐藥機制,為臨床抗感染治療提供實驗室依據(jù)。方法1.菌株收集收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院2015年5月-2015年10月間的耐碳青霉烯類(亞胺培南或美羅培南)目的菌株86株,每株菌株均采用VITEKⅡ全自動細菌鑒定儀鑒定到種,并采用VITEKⅡ配套藥敏卡片進行藥敏試驗,藥敏結果判定參考CLSI2014版標準。采用-20℃保存菌株。2.耐藥分析統(tǒng)計分析所收集菌株的科室分布、標本類型、各類常用抗生素耐藥率,并以同時期收集的86株碳青霉烯類敏感銅綠作為對照組,比較兩組菌株間耐藥性差異。比較方法采用卡方檢驗。3.表型確證將菌株復蘇后,挑取單個菌落制作0.5麥氏濁度菌懸液,均勻涂布M-H平板后,采用EDTA雙紙片增效試驗篩查產(chǎn)金屬酶的銅綠假單胞菌。4.基因檢測用特異性引物序列,采用聚合酶鏈式反應,檢測A、B、D類碳青霉烯酶,Oprd2孔道蛋白以及整合子。對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后,將陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序結果進行BLAST比對分析。結果1.科室、標本類型分布86株目的菌株主要來源于ICU 39個、介入科12個、神經(jīng)外科12個,其它科室23個。從標本類型上看,主要是痰標本70、灌洗液4、分泌物4,其他標本包括2個膽汁、2個引流液、2個尿、2個膿液。2.耐藥率分析耐碳青霉烯類藥物PA對于臨床常用抗菌藥物的耐藥率如下,阿米卡星40%、哌拉西林74%、頭孢他啶53%、頭孢吡肟47%、美羅培南89%、亞胺培南90%、氨曲南74%、環(huán)丙沙星51%、左氟沙星56%。由結果可知,菌株除了耐碳青霉烯類藥物外,對于氨基糖苷類、廣譜青霉素及喹諾酮類藥物均有較高的耐藥率。運用卡方檢驗分析與86株碳青霉烯類敏感菌對各類藥物的差異性,每組藥P均小于0.05,在α=0.05的檢驗水準下,認為耐碳青霉烯類PA和碳青霉烯類敏感PA對常見種類抗生素的耐藥率有顯著性差異。3.基因型檢測86株銅綠假單胞菌中擴增出B類金屬酶IMP11株、SIM2株、18株含有OXA-10,未檢測到A類碳青霉烯酶GES。86株銅綠假單胞菌中,有54株菌株存在孔道蛋白缺失,僅32株擴增出通道蛋白,孔道蛋白缺失率達到63%。4.整合子檢測86株目的菌中,26株擴增出Ⅰ類整合子,未擴增出Ⅱ、Ⅲ類整合子,4株擴增出1850bp長度的基因盒(dhfr XⅡ-orf F-aad A2),4株2000bp基因盒(aad B-aa C6-Ⅱ-PSE1),2株1270bp基因盒(aad A6-orf D),2株2000bp(imp26-qac G-aac A4),13株1000bp(aad A2),1株1600bp(aad A4-OXA142)結論:1.耐碳青霉烯類藥物銅綠假單胞菌往往具有多重耐藥性,臨床應加強監(jiān)測,嚴防此類菌株的擴散。2.河南地區(qū)分離PA對碳青霉烯類耐藥的主要機制為攜帶碳青霉烯酶以及通道蛋白的缺失。3.河南地區(qū)分離PA主要攜帶的為I類整合子,整合子所攜帶耐藥基因盒主要導致氨基糖苷類和碳青霉烯類耐藥。
【關鍵詞】：碳青霉烯類藥物 銅綠假單胞菌 耐藥機制
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 引言13-15
• 第一部分 耐碳青霉烯類藥物銅綠假單胞菌耐藥性分析15-21
• 1 材料與方法15-16
• 2 結果16-19
• 3 討論19-21
• 第二部分 耐碳青霉烯類藥物相關基因檢測21-35
• 1 材料和方法21-25
• 2 結果25-33
• 3 討論33-35
• 結論35-36
• 參考文獻36-40
• 綜述 銅綠假單胞菌耐藥機制研究進展40-59
• 參考文獻49-59
• 研究生期間研究成果59-60
• 致謝60

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