本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮細胞微粒對膿毒癥大鼠血管滲漏的作用及機制

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【摘要】：膿毒癥是由細菌感染引起的以全身性炎癥反應(yīng)為特征的臨床重癥,極易引起組織損傷及器官功能失調(diào),可導致多器官功能衰竭甚至死亡,是重癥監(jiān)護室中常見綜合征,死亡率一直居高不下,嚴重威脅患者健康。膿毒癥患者廣泛存在嚴重血管滲漏,即血管屏障功能下降,通透性增高,血液內(nèi)炎癥因子、補體、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)可異常透過內(nèi)皮屏障到達各組織器官,引起組織嚴重水腫,機體有效循環(huán)血容量顯著下降,嚴重影響組織及器官功能并危及患者生命。微粒(microparticle,MP)是一種幾乎所有細胞均可分泌的微小膜性囊泡,可在細胞凋亡或受到刺激時產(chǎn)生,直徑約為0.1—1μm,內(nèi)部可攜帶多種生物活性分子如蛋白質(zhì)、DNA、RNA等。目前研究已證實,MP能夠廣泛參與炎癥、凝血、免疫抑制等病理生理過程,可在多種疾病如動脈粥樣硬化、心肌炎、子癇前期、急性肺損傷、慢性腎炎等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。已有研究表明,膿毒癥后MP含量可顯著增加,可以通過調(diào)節(jié)一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶、活性氧簇等信號分子影響內(nèi)皮功能,調(diào)節(jié)血管舒縮反應(yīng)。而MP是否能夠調(diào)節(jié)膿毒癥后血管滲漏以及哪種MP在其中起到主要作用目前仍不清楚。據(jù)此,本研究使用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal Ligation and Puncture operation,CLP)復制大鼠膿毒癥模型及LPS刺激肺靜脈內(nèi)皮細胞,分別從整體及離體水平研究MP對膿毒癥血管滲漏的調(diào)節(jié)作用并初步探討其機制,最后從臨床膿毒癥患者血液中收集MP,驗證MP對膿毒癥血管滲漏的作用。具體內(nèi)容包括三部分:(1)MP在膿毒癥后血管滲漏中的作用;(2)MP調(diào)節(jié)膿毒癥后血管滲漏的機制;(3)臨床膿毒癥患者MP對大鼠血管滲漏的作用。主要實驗方法:使用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)復制大鼠膿毒癥模型,差速離心法收集并純化MP,流式細胞儀及透射電鏡對MP進行鑒定;異硫氰酸熒光素標記的熒光白蛋白(Fluorescein isothiocyanate-Bovine Serum Albumin,FITC-BSA)檢測血管滲漏情況;提取大鼠肺靜脈內(nèi)皮細胞,檢測跨膜電阻(Trans Electric Resistance,TER)及FITC-BSA透過率;RT-q PCR法測定MP中微小核糖核酸(micro RNA,miR)含量;蛋白免疫印跡及免疫熒光檢測內(nèi)皮細胞緊密連接ZO-1表達。研究內(nèi)容:第一部分EMP在膿毒癥后血管滲漏中的作用1、使用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)復制大鼠膿毒癥模型,檢測大鼠膿毒癥后肺、腎、腸血管滲漏變化;收集膿毒癥大鼠血液中MP并檢測其含量。2、使用膿毒癥大鼠血液中MP作用于正常大鼠,檢測其對大鼠肺、腎、腸血管滲漏的作用。同時從正常大鼠中提取肺靜脈內(nèi)皮細胞、中性粒細胞及血小板,分別使用LPS刺激后制備內(nèi)皮細胞微粒(Endothelial microparticle,EMP)、中性粒細胞微粒(Neutrophil microparticle,NMP)及血小板微粒(Platelet microparticle,PMP),檢測不同來源MP對肺血管滲漏的影響。3、使用Transwell培養(yǎng)單層肺靜脈內(nèi)皮細胞,利用EMP刺激內(nèi)皮細胞,檢測TER及FITC-BSA透過率變化;使用免疫熒光及Western Blotting檢測EMP刺激對內(nèi)皮細胞緊密連接ZO-1表達的影響。第二部分EMP調(diào)節(jié)血管滲漏的機制1、分別提取膿毒癥大鼠MP及經(jīng)LPS刺激的EMP中miR,使用RT-q PCR檢測血管滲漏miR表達變化。2、使用LPS刺激經(jīng)miR-23b干擾過的肺靜脈內(nèi)皮細胞,收集miR-23b(-)EMP并刺激內(nèi)皮細胞,檢測TER、FITC-BSA透過率變化及緊密連接ZO-1表達變化。第三部分膿毒癥患者MP對大鼠血管滲漏的作用1、收集臨床10名膿毒癥患者及10名健康成人血液中MP,對比其含量差異。2、收集臨床膿毒癥患者血液中MP,作用于正常大鼠及內(nèi)皮細胞,分別檢測肺血管滲漏及TER、FITC-BSA、ZO-1表達變化。主要研究結(jié)果:第一部分EMP在膿毒癥后血管滲漏中的作用1、大鼠膿毒癥后肺、腎、腸血管血管滲漏程度及MP含量顯著增加,且不同時相點兩者增加程度基本一致。2、膿毒癥大鼠MP可明顯增加正常大鼠肺、腎、腸血管滲漏。經(jīng)LPS刺激的EMP可明顯增加正常大鼠肺血管滲漏,而LPS刺激的NMP及PMP對大鼠肺血管滲漏無明顯作用。3、LPS刺激的EMP可以明顯降低內(nèi)皮細胞單層跨膜電阻值,增加FITC-BSA的透過率,顯著降低肺靜脈內(nèi)皮細胞ZO-1表達。第二部分EMP調(diào)節(jié)膿毒癥后血管滲漏的機制1、膿毒癥后MP中miR-23b、miR-29a、miR-125a、miR-126a、miR-181a、miR-199a、miR-203、miR374含量增加較為顯著,經(jīng)LPS刺激的EMP內(nèi)miR-23b增加最為顯著。2、抑制EMP內(nèi)miR-23b表達后,可顯著降低EMP引起的內(nèi)皮細胞通透性增高,表現(xiàn)為跨膜電阻值、FITC-BSA透過率及ZO-1表達與正常組相比均無明顯差異。第三部分膿毒癥患者MP對大鼠血管滲漏的作用1、膿毒癥患者MP含量明顯高于健康成人。2、膿毒癥患者MP可顯著增加大鼠肺血管滲漏,且增加內(nèi)皮細胞通透性。結(jié)論:1、膿毒癥后血液中MP含量顯著增加,并可顯著增加大鼠血管滲漏,EMP在其中發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用。2、膿毒癥后EMP內(nèi)miR-23b改變最為顯著,miR-23b在EMP調(diào)節(jié)血管滲漏中起到重要作用。3、臨床膿毒癥患者研究證實了前期動物實驗結(jié)果,即膿毒癥患者MP含量顯著增加,膿毒癥患者MP可顯著增加大鼠血管滲漏。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 血管滲漏 miR-23b ZO-1
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 內(nèi)皮細胞微粒對膿毒癥大鼠血管滲漏的作用及機制14-50
• 2.1 材料和實驗方法14-35
• 2.2 實驗結(jié)果35-46
• 2.3 討論46-49
• 2.4 小結(jié)49-50
• 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻51-54
• 文獻綜述 微粒在膿毒癥中的作用及進展54-65
• 參考文獻61-65
• 附件65-76
• 攻讀碩士學位期間的研究成果76-77
• 致謝77

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2 張振輝;林s鉅，

本文編號：824165