本文關(guān)鍵詞：丙肝病毒核心抗原新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的建立與初步應(yīng)用

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【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題,據(jù)統(tǒng)計(jì)全球范圍內(nèi)HCV慢性感染的人數(shù)約1.7億,每年新增HCV感染者300-400萬(wàn),約80%的感染者會(huì)發(fā)展為慢性肝炎,10~20%的感染者會(huì)進(jìn)展為肝硬化?肝癌。HCV屬黃病毒科肝病毒屬的單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)9.6kb,可編碼出1個(gè)約3010個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體,經(jīng)過(guò)剪接后形成功能性的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV核心蛋白位于多聚蛋白前體的N端,與其他蛋白相比,在不同HCV基因型間核心蛋白的氨基酸序列十分保守,且在HCV感染的早期就會(huì)出現(xiàn)在血液中,現(xiàn)已成為檢測(cè)HCV感染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。精準(zhǔn)的檢測(cè)手段對(duì)于控制HCV傳播和臨床治療十分重要,目前HCV感染診斷多依據(jù)血清中檢出抗-HCV抗體,但抗-HCV抗體檢測(cè)無(wú)法區(qū)分活躍感染期和感染恢復(fù)期,且其檢測(cè)的“窗口期”較長(zhǎng)(45~68天)。HCV-RNA檢測(cè)為目前HCV感染的確診手段,靈敏度較高,但易受免疫應(yīng)答反應(yīng)的干擾,無(wú)法完全取代免疫學(xué)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。HCV核心抗原(HCV core antigen,HCVc Ag)檢測(cè)雖無(wú)“窗口期”的限制,且已有檢測(cè)試劑盒上市,但檢測(cè)原理多基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA),無(wú)法滿足低濃度樣本的檢測(cè)要求,所以探索超靈敏的HCVc Ag免疫學(xué)檢測(cè)方法十分必要。2003年,Mirkin首次報(bào)道了生物條形碼檢測(cè)技術(shù)(bio-barcode assay,BCA),它巧妙地將病原蛋白的檢測(cè)轉(zhuǎn)化為核酸檢測(cè),其突出特點(diǎn)是具有極高的檢測(cè)靈敏度。本研究在BCA技術(shù)的基礎(chǔ)上,優(yōu)化金納米探針(gold nanoparticles probes,GNP)和三明治復(fù)合物檢測(cè)步驟,將其與基于Taq Man探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(fluorescence-based quantitative real-time PCR,q PCR)相結(jié)合,建立了HCVc Ag新型BCA檢測(cè)技術(shù)。研究主要包括以下4部分:1.條形碼DNA的設(shè)計(jì)及其參考品的制備在Gen Bank中選擇一段與HCV同源關(guān)系較遠(yuǎn)的植物基因?yàn)樗{(lán)本,設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)HCVc Ag新型BCA檢測(cè)的條形碼DNA序列及其引物和Taq Man探針序列,并對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的條形碼DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后,將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到p MD-18T載體上,轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)Amp+抗性篩選和菌落PCR鑒定出陽(yáng)性菌落,然后用Amp+液體培養(yǎng)基增殖陽(yáng)性菌落,提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定。優(yōu)化條形碼DNA q PCR檢測(cè)體系的重要反應(yīng)參數(shù),然后以一系列梯度稀釋的條形碼DNA參考品質(zhì)粒為模板,建立q PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對(duì)建立的條形碼DNA q PCR定量方法進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià)。2.GNP探針、MMP探針的合成和鑒定 鑒定出活性較好、無(wú)交叉反應(yīng)的HCVc Ag多克隆抗體和單克隆抗體組合,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建HCVc Ag雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系,體系的檢測(cè)靈敏度可達(dá)2ng/m L。將HCVc Ag多克隆抗體包被到金納米顆粒上,并對(duì)多抗包被量進(jìn)行優(yōu)化,然后把巰基標(biāo)記的條形碼DNA包被到“金納米顆粒-HCVc Ag多抗”復(fù)合物上。用DNase I處理標(biāo)記后的金納米復(fù)合物,并優(yōu)化處理時(shí)間,盡可能地去除未標(biāo)記的條形碼DNA,減少GNP探針表面條形碼DNA的損耗。分別用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)、紫外-可見(jiàn)分光光度測(cè)定法(ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-vis)、斑點(diǎn)ELISA和q PCR檢測(cè)體系對(duì)GNP探針表面包被的HCVc Ag多抗和條形碼DNA進(jìn)行鑒定,得到的GNP探針濃度為1.22×10-9M。將HCVc Ag單克隆抗體包被到磺酰基修飾的磁性微球上,制成磁性微球探針(magnetic microparticles,MMP),鑒定包被效率為75.6%,斑點(diǎn)ELISA鑒定包被的抗體顯示出良好的活性。3.HCVc Ag新型BCA檢測(cè)體系的優(yōu)化和評(píng)價(jià)首先驗(yàn)證一定體積范圍內(nèi),MMP探針對(duì)條形碼DNA的q PCR檢測(cè)體系無(wú)明顯影響,然后優(yōu)化新型BCA檢測(cè)體系中GNP探針和MMP探針的反應(yīng)比例。基于優(yōu)化的結(jié)果,將2個(gè)探針與HCVc Ag反應(yīng)形成“GNP-HCVc Ag-MMP”三明治復(fù)合物,不釋放三明治復(fù)合物中的條形碼DNA,直接用q PCR檢測(cè)體系檢測(cè)三明治復(fù)合物。分別對(duì)新型BCA檢測(cè)體系的靈敏度、特異性和重復(fù)性進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)結(jié)果:新型BCA檢測(cè)體系檢測(cè)重組HCVc Ag的靈敏度達(dá)到1fg/m L,約為常規(guī)ELISA法的106倍;對(duì)114份不同來(lái)源的抗-HCV抗體陰性血清樣本進(jìn)行測(cè)定,特異性達(dá)到98.2%;批間和批內(nèi)的變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)均小于5%,重復(fù)性良好。4.HCVcAg新型BCA檢測(cè)體系的初步應(yīng)用利用商品化HCVc Ag和HCV-RNA檢測(cè)試劑盒對(duì)已知抗-HCV抗體陽(yáng)性的血清樣本進(jìn)行檢測(cè),然后再用HCVc Ag新型BCA檢測(cè)體系檢測(cè),結(jié)果新型BCA技術(shù)的檢出率低于商品化HCVc Ag試劑盒。結(jié)合新型BCA檢測(cè)的特異性評(píng)價(jià)結(jié)果,顯示建立的新型BCA檢測(cè)體系適用于未產(chǎn)生抗-HCV抗體前的血液樣本的測(cè)定。綜上所述,本研究初步建立了HCVc Ag新型BCA檢測(cè)體系,并對(duì)體系進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)和初步應(yīng)用。該檢測(cè)體系雖然在血清樣本的檢測(cè)方面仍需改進(jìn),但為血液中HCVc Ag超靈敏檢測(cè)奠定了基礎(chǔ),對(duì)推動(dòng)血液病毒蛋白檢測(cè)的研究發(fā)展以及保障血液安全具有重大意義。
【關(guān)鍵詞】：丙肝病毒核心抗原 條形碼DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 新型BCA檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R512.63;R446.6
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-27
• 1 材料14-15
• 1.1 試劑14-15
• 1.2 主要儀器15
• 1.3 血清樣本15
• 2 條形碼DNA熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立15-18
• 2.1 條形碼DNA的確立15-16
• 2.2 條形碼DNA參考品質(zhì)粒的構(gòu)建16-17
• 2.3 熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立17-18
• 3 GNP探針的制備與鑒定18-22
• 3.1 HCVc Ag多克隆抗體和單克隆抗體活性的鑒定18-19
• 3.2 GNP探針的制備19-21
• 3.3 GNP探針的鑒定21-22
• 4 MMP探針的制備與鑒定22-23
• 4.1 磁性微球-HCVc Ag單抗復(fù)合物的制備22-23
• 4.2 MMP探針的鑒定23
• 5“GNP-HCVc Ag-MMP”三明治復(fù)合物反應(yīng)體系的建立23-25
• 5.1 三明治復(fù)合物反應(yīng)體系中反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化23-24
• 5.2“GNP-HCVc Ag-MMP”三明治復(fù)合物的形成和檢測(cè)24-25
• 6 HCVc Ag新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)25-26
• 6.1 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的靈敏度評(píng)價(jià)25
• 6.2 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的特異性評(píng)價(jià)25
• 6.3 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的重復(fù)性評(píng)價(jià)25-26
• 7 HCVc Ag新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的初步應(yīng)用26-27
• 7.1 臨床樣本HCVc Ag的ELISA法檢測(cè)26
• 7.2 臨床樣本的HCVc Ag新型BCA檢測(cè)26-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-40
• 1 條形碼DNA熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立27-30
• 1.1 條形碼DNA的生物信息學(xué)分析和優(yōu)化27-28
• 1.2 條形碼DNA參考品質(zhì)粒的鑒定28-29
• 1.3 條形碼DNA熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立29-30
• 2 GNP的制備與鑒定結(jié)果30-34
• 2.1 HCVc Ag雙抗體夾心ELISA法的建立30-31
• 2.2 GNP探針制備參數(shù)的優(yōu)化31-32
• 2.3 GNP探針的鑒定32-34
• 3 MMP探針標(biāo)記HCVc Ag單抗的鑒定34-35
• 3.1 HCVc Ag單抗標(biāo)記效率的鑒定34-35
• 3.2 MMP探針中HCVc Ag單抗活性的鑒定35
• 4“GNP-HCVc Ag-MMP”三明治復(fù)合物的形成優(yōu)化和檢測(cè)35-36
• 4.1 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)中反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化35-36
• 4.2“GNP-HCVc Ag-MMP”三明治復(fù)合物的檢測(cè)36
• 5 HCVc Ag新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)36-38
• 5.1 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的靈敏度評(píng)價(jià)36-37
• 5.2 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的特異性評(píng)價(jià)37-38
• 5.3 新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的重復(fù)性評(píng)價(jià)38
• 6 HCVc Ag新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的初步應(yīng)用38-40
• 6.1 臨床樣本的ELISA法檢測(cè)38-39
• 6.2 臨床樣本HCVc Ag的新型BCA檢測(cè)39-40
• 討論40-43
• 1 條形碼DNA熒光定量PCR檢測(cè)體系的優(yōu)勢(shì)40
• 2 GNP探針中未標(biāo)記條形碼DNA的去除40-42
• 3 HCVc Ag新型生物條形碼檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和不足42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷48-49
• 致謝49

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