本文關(guān)鍵詞：基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗體檢測方法的建立與初步應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 慢病毒載體包裝系統(tǒng) H7N9流感病毒 假病毒 中和試驗(yàn)

【摘要】：背景2013年3月31日中國首次報(bào)道了人感染H7N9禽流感病例,截止5月19日,已確診病例786例,包括307。雖然目前沒有明確的證據(jù)說明H7N9能否人傳人,但是家庭聚集性病例的報(bào)道提示H7N9流感病毒有大流行的可能性。A/Anhui/1/2013(H7N9)是目前WHO推薦的H7N9流感病毒疫苗候選株之一,但經(jīng)典疫苗效果評(píng)價(jià)與血清學(xué)感染調(diào)查的中和試驗(yàn)均涉及H7N9真病毒,需在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,存在一定的生物安全隱患,及實(shí)驗(yàn)實(shí)施的不便利性。而假型病毒與真病毒相比只能一次性感染細(xì)胞、宿主范圍廣、滴度高、不易被血清補(bǔ)體滅活,可以代替真病毒進(jìn)行中和抗體檢測。研究目的構(gòu)建A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病毒株假病毒,并在此基礎(chǔ)上建立基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗體檢測方法,為H7N9流感病毒的防控提供參考。研究方法與結(jié)果一、確定了H7N9流感假病毒制備的最優(yōu)重配方案為了確定H7N9流感假病毒制備的最優(yōu)重配方案,采用基于慢病毒載體的假病毒包裝系統(tǒng),構(gòu)建了三株不同血凝素(hemagglutinin,HA)與神經(jīng)氨酸酶(neutraminidase,NA)重配但均表達(dá)A/Anhui/1/2013(H7N9)流感病血凝素HA的假病毒,結(jié)果表明H7N9流感病毒自身基因優(yōu)化型HA和NA重配可獲得高感染力與良好血凝活性的AHop-H7N9pp假病毒。確定后續(xù)假病毒制備條件優(yōu)化研究選用此重配方式。二、 AHop-H7N9pp假病毒制備條件參數(shù)的優(yōu)化及生物學(xué)活性分析為了確定AHop-H7N9pp假病毒制備的最優(yōu)條件,本研究對(duì)假病毒制備相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,包括膜質(zhì)粒組合、膜質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒配比、質(zhì)粒復(fù)合物與轉(zhuǎn)染試劑配比、維持液血清濃度、換液時(shí)間、收貨時(shí)間等,并對(duì)優(yōu)化條件后制備假病毒的生物學(xué)活性進(jìn)行分析。結(jié)果如下：①假病毒制備質(zhì)粒相關(guān)參數(shù)優(yōu)化確定為：以H7N9自身HA與NA作為膜質(zhì)粒,采用骨架質(zhì)粒與膜質(zhì)粒質(zhì)量比為3：1,質(zhì)粒復(fù)合物與轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量體積比為1：2混合,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后相關(guān)參數(shù)優(yōu)化確定為：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后10h換含2%FBS的維持液,培養(yǎng)48h后收獲上清。③確定了假病毒收獲后純化方法。為了后期使用假病毒的均一性及便于儲(chǔ)存,批量制備假病毒的純化方案為：收獲的假病毒上清液經(jīng)2500rpm離心5min,然后使用20%蔗糖墊層24000rpm超離2h,可高效獲得流感假病毒AHop-H7N9pp。④純化的假病毒對(duì)多種流感疫苗小鼠血清中和試驗(yàn)結(jié)果表明,該假病毒具有高度特異性,可用于H7N9中和抗體檢測。三、基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗體檢測完成基于假病毒的10份H7N9病人恢復(fù)期血清及1120份H7N9人群流調(diào)血清中和抗體的檢測,結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的基于H7N9假病毒的中和抗體檢測方法與真病毒中和試驗(yàn)方法具有良好的相關(guān)性。結(jié)論本研究確定了基于慢病毒載體包裝系統(tǒng)制備表達(dá)A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒HA與NA的H7N9假病毒的各條件參數(shù),獲得了具有高感染性、良好血凝活性及中和型特異性的AHop-H7N9pp假病毒；并建立了基于此假病毒的H7N9流感病毒中和抗體檢測方法,為我國H7N9流感病中和抗體檢測提供了新的技術(shù)參考。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒載體包裝系統(tǒng) H7N9流感病毒 假病毒 中和試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446.6
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文縮略詞表11-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-24
• 結(jié)果24-40
• 第一部分 三種重配方案對(duì)表達(dá)H7N9流感病毒安徽株HA的假病毒感染性和血凝活性的影響24-29
• 一、假病毒制備所需質(zhì)粒的鑒定與提取24-25
• 二、三種重配方案均能包裝出含有HA蛋白和p24抗原的假病毒25
• 三、三種重配方案均能包裝出具有感染活性的假病毒25-26
• 四、H7N9安徽株自身HA和NA重配可獲得良好血凝活性的假病毒26-28
• 小結(jié)28-29
• 第二部分 AH_(op)-H7N9pp流感假病毒制備條件的優(yōu)化及生物學(xué)活性分析29-36
• 一、假病毒制備條件的優(yōu)化29-30
• 二、假病毒生物學(xué)活性的鑒定30-35
• 小結(jié)35-36
• 第三部分 基于假病毒的H7N9流感病毒中和抗體檢測36-40
• 一、AH_(op)-H7N9pp假病毒中和試驗(yàn)與真病毒中和試驗(yàn)結(jié)果具有較好相關(guān)36-37
• 二、H7N9流感病毒人群流調(diào)血清中和抗體檢測37-39
• 小結(jié)39-40
• 討論40-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 綜述48-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59-60
• 個(gè)人簡歷60-62

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本文編號(hào)：766256