本文關(guān)鍵詞：苛求芽孢桿菌尿酸酶體外定向進化系統(tǒng)及應(yīng)用

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【摘要】：采用易錯PCR(error-prone PCR,epPCR)技術(shù)對天然苛求芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶三段氨基酸區(qū)域(A1-V150;V150-D212;Q160-L322)對應(yīng)編碼基因進行體外隨機突變,在不影響PCR產(chǎn)物生成量的前提下,通過增加反應(yīng)體系中MnCl2濃度至1.5 mM,提高突變率至4.4%;通過epPCR反應(yīng)后快速加入2.0 mM EDTA-Na2溶液消除高濃度Mn2+對連接效率的影響;采用同源重組克隆方法實現(xiàn)表達載體突變體庫的構(gòu)建。突變體單克隆接種于48孔細胞培養(yǎng)板進行細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達,誘導(dǎo)后細胞懸液以1:9體積比加至含1.0 M Tris-HCl(pH 9.0)緩沖液的96孔細胞培養(yǎng)板(含0.1%吐溫-20,1.0 mM 4-氨基苯甲脒二磷酸鹽緩沖液),室溫下于微孔板快速振蕩器中裂解7.5-10.5h;使用150μM底物在酶標(biāo)儀上于298 nm檢測尿酸酶反應(yīng)過程;分析酶動力學(xué)過程確定裂解液中尿酸酶活性Vm/Km。動力學(xué)過程分析法確定尿酸酶活性Vm/Km對初始底物濃度不敏感,且定量上限為經(jīng)典初速度法的3倍。基于所述高通量篩選系統(tǒng),選取活性之比分別為1.8倍(天然尿酸酶VS L322D-SN-6His)和3.3倍(天然尿酸酶VS E2R/L322D-SN-6His)的兩對尿酸酶突變體作為測試菌株,應(yīng)用受試者工作曲線(Receiver Operation Curve,ROC)比較用Vm/Km識別活性提高一倍以上陽性突變體的可靠性。當(dāng)活性之比為3.3時,對應(yīng)堿裂解方法曲線下面積(Area Under Curve,AUC)為0.957;與經(jīng)典超聲裂解法相當(dāng)(AUC=0.978)。將尤登指數(shù)最大時對應(yīng)Vm/Km作為判斷尿酸酶突變體活性提高1倍以上的參考閾值,相當(dāng)于以模板尿酸酶活性均值加上3.6倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。用所建立定向進化系統(tǒng),對近400個單克隆高通量篩選,獲得一株活性提高的陽性尿酸酶協(xié)同突變體L171I/Y182F/Y187F/A193S。此突變體活性較天然尿酸酶提高了約60%,但其生理條件下熱穩(wěn)定性較差,僅為天然酶的1/70。綜上所述,所建立的定向進化系統(tǒng)可以用來進行苛求芽孢桿菌尿酸酶的體外定向分子改造篩選高活性突變體。
【關(guān)鍵詞】：尿酸酶 定向進化 高通量篩選 細胞裂解液 突變率
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R440
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 第一部分 苛求芽孢桿菌尿酸酶突變體庫的構(gòu)建12-23
• 1 材料與方法12-18
• 2 結(jié)果18-22
• 3 本部分小結(jié)22-23
• 第二部分 苛求芽孢桿菌尿酸酶突變體庫高通量篩選系統(tǒng)的構(gòu)建23-34
• 1 材料與方法23-24
• 2 試驗方法24-25
• 3 結(jié)果25-33
• 4 本部分小結(jié)33-34
• 第三部分 突變體L171I/Y182F/Y187F/A193S的表征34-45
• 1 材料與方法34-36
• 2 試驗方法36-39
• 3 結(jié)果39-44
• 4 本部分小結(jié)44-45
• 全文總結(jié)45-46
• 參考文獻46-50
• 致謝50-51
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文51

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉苗苗;馮娟;劉紅博;楊曉蘭;馮麗萍;李元麗;廖飛;;二甲基酚橙法測定尿酸酶活性和識別尿酸酶高活性突變體[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;2013年03期

2 ;Science Letters:Evaluation of a kinetic uricase method for serum uric acid assay by predicting background absorbance of uricase reaction solution with an integrated method[J];Journal of Zhejiang University Science(Life Science);2006年06期

3 廖飛,楊曉,周岐新,曾昭淳,左渝萍;Fast estimation of Michaelis-Menten constant of arylesterase with a pair of medium concentrations of substrate[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2003年05期

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本文編號：733689