本文關(guān)鍵詞：毛囊源性間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)遷移及歸巢的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 毛囊 間充質(zhì)干細(xì)胞 熒光素酶報告基因 遷移 歸巢

【摘要】：研究背景:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。MSCs具有來源廣泛、易于獲取、免疫原性低、無致瘤性、應(yīng)用不涉及倫理學(xué)等的優(yōu)點(diǎn),可作為理想的種子細(xì)胞,用于抗衰老和組織的損傷修復(fù)。毛囊來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(h HF-MSCs)可以通過直接拔取毛發(fā)的方法獲得,不僅來源豐富,而且獲取方便。新近研究發(fā)現(xiàn)h HF-MSCs可以修復(fù)多種受損的組織,如心肌、皮膚和神經(jīng)等。研究表明干細(xì)胞遷移、歸巢與其療效緊密相關(guān)。然而h HF-MSCs移植后在體內(nèi)的遷移、歸巢等情況目前未見報道。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探究h HF-MSCs移植后在小鼠體內(nèi)的遷移、歸巢。實(shí)驗(yàn)方法:1.通過直接拔取志愿者毛發(fā)的方式獲取毛囊,經(jīng)過蛋白酶消化,分離出h HF-MSCs,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物的表達(dá);采用油紅O及茜素紅S染色分別檢測h HF-MSCs成脂、成骨分化能力。2.構(gòu)建表達(dá)熒光素酶和綠色熒光蛋白雙報告基因的慢病毒質(zhì)粒(Luc-e GFP),與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,制備慢病毒顆粒,經(jīng)過低溫超高速離心濃縮后,感染標(biāo)記h HF-MSCs;利用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞化學(xué)染色檢測Luc-e GFP標(biāo)記后h HF-MSCs(LG-h HF-MSCs)的表面標(biāo)志物表達(dá)及其成脂和成骨能力;利用分子影像學(xué)技術(shù)體外檢測LG-h HF-MSCs熒光素酶活性,建立細(xì)胞數(shù)量-酶活性量效曲線。3.將LG-h HF-MSCs通過尾靜脈注射到NOD/SCID小鼠體內(nèi),監(jiān)測小鼠體重的改變。利用小動物活體成像技術(shù)和PCR檢測LG-h HF-MSCs在小鼠體內(nèi)的分布,HE染色檢測LG-h HF-MSCs移植小鼠主要臟器組織結(jié)構(gòu)。利用全自動生化分析儀檢測LG-h HF-MSCs移植后小鼠肝功、腎功和心功能改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.h HF-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定通過直接拔取志愿者頭部毛發(fā),經(jīng)酶消化法,分離獲得h HF-MSCs。鏡下可見h HF-MSCs呈長梭樣,細(xì)胞免疫熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,h HF-MSCs表達(dá)CD105、CD73、CD44、CD90,不表達(dá)CD31、CD34。細(xì)胞化學(xué)染色顯示,在特定的培養(yǎng)條件下,h HF-MSCs具有成脂和成骨分化能力。2.Luc-e GFP標(biāo)記h HF-MSCs的制備構(gòu)建含Luc-e GFP雙報告基因的慢病毒表達(dá)載體,與慢病毒包裝質(zhì)粒(p MDL-g/p,p SRV-rev,p MD2.G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,制備慢病毒顆粒,感染h HF-MSCs,制備出Luc-e GFP雙報告基因標(biāo)記的h HF-MSCs的細(xì)胞(LG-h HF-MSCs)。鏡下觀察LG-h HF-MSCs呈長梭形,不僅表達(dá)e GFP(表達(dá)率在92%以上),還表達(dá)CD73、CD44、CD90、CD105,同時具有成脂和成骨分化能力;分子影像學(xué)檢測結(jié)果顯示:隨著LG-h HF-MSCs細(xì)胞數(shù)量的增多,熒光素酶活性增強(qiáng),兩者呈顯著的正相關(guān)(R2=0.99)。3.LG-h HF-MSCs體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)LG-h HF-MSCs經(jīng)尾靜脈注射移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi),實(shí)驗(yàn)期間,小鼠體重逐漸上升、生長狀態(tài)良好、與正常組及PBS組比無顯著差別;分子影像學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),LG-h HF-MSCs移植后1、3、7天,BLI信號主要分布在小鼠肺部,且信號強(qiáng)度隨著時間推移而逐漸減弱。ALU-PCR檢測顯示心、肺、脾組織中存在人類特異基因ALU基因表達(dá),且ALU基因隨時間推移逐漸減弱;肝組織3天組ALU基因表達(dá)最強(qiáng);腎組織中僅1天組中ALU基因表達(dá);皮膚中ALU基因表達(dá)隨時間推移逐漸增強(qiáng);而腦組織中ALU基因無比表達(dá)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)LG-h HF-MSCs移植后,遷移歸巢到小鼠肺部。HE染色顯示LG-h HF-MSCs移植小鼠主要臟器臟組織結(jié)構(gòu)與正常組及PBS組比無顯著差別。生化功能檢測LG-h HF-MSCs移植小鼠肝功、腎功和心功能與正常組及PBS組比無顯著差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:h HF-MSCs移植后7天內(nèi)主要遷移歸巢到小鼠肺部組織,小鼠主要臟器組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化功能未見異常。
【關(guān)鍵詞】：毛囊 間充質(zhì)干細(xì)胞 熒光素酶報告基因 遷移 歸巢
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7
【目錄】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 中英文縮略詞對照表13-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-20
• 1. 干細(xì)胞移植治療14-15
• 1.1 胚胎干細(xì)胞移植治療14-15
• 1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療15
• 2. 毛囊15-17
• 2.1 毛囊的結(jié)構(gòu)15-16
• 2.2 毛囊來源的間充質(zhì)干細(xì)胞16-17
• 3. 干細(xì)胞標(biāo)記示蹤技術(shù)17-19
• 3.1 放射性核素標(biāo)記技術(shù)17
• 3.2 磁標(biāo)記技術(shù)17-18
• 3.3 熒光標(biāo)記技術(shù)18
• 3.4 生物發(fā)光成像技術(shù)18-19
• 4. 總結(jié)與展望19-20
• 第二篇 實(shí)驗(yàn)研究20-43
• 第1章 hHF-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定20-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-24
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-26
• 1.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)26-27
• 第2章 Luc-e GFP標(biāo)記的hHF-MSCs的制備27-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 2.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)33-34
• 第3章 LG-hHF-MSCs體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)34-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-42
• 3.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)42-43
• 第三篇 討論43-47
• 第四篇 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 作者簡介及在校期間所獲科研成果53-54
• 致謝54

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本文編號：703589